استخدام التقنيات الحيوية في التحسين الوراثي للموالح

ساعد التقدم في مجال التقنية الحيوية على الحل النسبي أو الإقلال من بعض أوجه القصور الموجودة في التربية التقليدية للموالح، وقد استخدمت طريقة تحليل الأيزوزومات للتعرف والتفرقة بين الهجن والبادرات النيوسيلية وهو اختبار يمكن الاعتماد عليه لهذا الهدف بجانب أنها دقيقة للتعرف على الهجن بما فيها معظم الهجن النوعية ولكنها لا يمكن أن تميز بين الأصناف القريبة من بعضها.

ومن المعلوم أن الموالح غير متجانسة وراثيا بدرجة كبيرة (1988 ,Roose) ولكن يسمح الحجم الصغير للجينوم في الموالح بإجراء اختبار Southern plot باستخدام 2-1 ميكروجرام/Lane حيث يظهر ذلك علاقة قوية وصورة مفردة للعوامل الوراثية ويتم ذلك باستخدام الإشعاع المصور Autoradiography خلال يوم واحد، وتم عمل خرائط وراثية للموالح مبنية على تقنيه RFLP والأيزوزومات في كل من كاليفورنيا (1992 ,Jarrel et al) وفلوريدا (1992 ,Durham et al و 1990 ,Liou) ويستخدم المجموعتان دلائل Primers متشابهة مما يمكن معه مقارنة النتائج، وعن طريق هذه الخرائط يمكن تحديد مواقع العوامل الوراثية ذات الوظيفة أو الوظائف المحددة أي بمعنى آخر ربط العامل الوراثي بموقعه على الكروموزوم مع وظيفته المحددة التي يقوم بها، كما يمكن عن طريق ذلك تحديد عوامل وراثية داله (کاشفه) Marker genes على كروموزومات معينة والتي يكون بعضها مرتبطا ببعض العوامل الوراثية الأخرى المسئولة عن مقاومة الأمراض مثلا أو صفة تحمل الصقيع أو غيرها من الصفات ذات الأهمية البستانية. وعن طريق عمل خرائط لهذه العوامل الكاشفة يمكن عمل افتراضات عن وراثة عامل وراثي مرتبط خاص. وعلى ذلك أمكن التعرف على مواقع العوامل الوراثية باستخدام التقنية البيولوجية الجزيئية ثم استخدام هذه المعلومات للتعرف على الهجن المحتوية على العوامل الوراثية المرغوبة واستبعاد الهجن التي تحمل عوامل وراثية غير مرغوبة مما يقلل نسبيا من الحاجة لعمل العديد من التهجينات. وتساعد هذه الطريقة في استبعاد العديد من البادرات التي لا تحمل الصفات المرغوبة مما يقلل من إعداد البادرات التي يجري تقييمها.

وقد استخدمت التقنيات البيولوجية الجزيئية لإدخال المقاومة لمرض التريستيزا في النارنج وذلك عن طريق الهندسة الوراثية Gene transformation وذلك بنقل العامل الوراثي المراد نقله إلى بلازميد البكتريا أولا Bacterial plasmid والذي يعمل كحامل للصفة (البلازميد عبارة عن جزء دائري من DNA والذي يمكن فصله عند مواقع محدده بعدها يمكن إدخال العامل الوراثي الجديد فيه)، ثم تستخدم بكتريا من نوع خاص لإدخال العامل الوراثي وجزء بسيط من DNA البكتريا في أنسجة مزارع أنسجة النبات، وبدخول هذا DNA تصبح هذه الأنسجة معدلة وراثيا وتبدأ في إنتاج بروتينات خاصة تأخذ الشفرة من الجزء الذي أدخل في تركيب الDNA مع فرض أن ذلك لا يسبب أي تغيرات غير مرغوبة في النبات. ويزرع النسيج المعدل وراثيا على بيئة خاصة إلى أن يتم تكون النبتات Plantlets ثم تتكون عليها مجموع جذري وبعدها يمكن نقل النبات المعدل وراثيا إلى الصوبة ثم إلى الحقل. وقد أنتجت مثل هذه النبتات في العديد من الأنواع بما فيها الموالح، كما يمكن إدخال جزء الDNA في التركيب الوراثي للنبات مباشرة في الهدف باستخدام بندقية الجينات Gene gun عالية السرعة أو غيرها من الطرق الأخرى.

دور مزارع الأنسجة في التحسين الوراثي:

تم إكثار الموالح باستخدام تقنية زراعة الأنسجة للعديد من السنوات، وقد استخدمت هذه التقنية في بعض الأحيان في برامج التربية، وقد لوحظ أن الأجزاء النباتية المستخدمة في هذه التقنية والتي تسمى Explants إذا أخذت من العقد تكون أكثر احتمالا في إنتاج نباتات مطابقة للأصل ولكن التي تؤخذ من السلاميات تعطي نباتات غير مطابقة للأصل (1986 ,Barlass and Skene)، وأن الأنسجة التي يتم الحصول عليها من البادرات تكون أكثر سهولة في إكثارها في مزارع الأنسجة عن التي تؤخذ من النباتات الناضجة. ويمكن إنتاج سوق وبراعم من زراعة الأنسجة من الأجزاء المأخوذة من القمم النامية أو الجذور، وتكون الأجنة الخضرية مفيدة لدرجة كبيرة لاستخدامها في الموالح لأن العديد من التراكيب الوراثية تمتلك القدرة على إنتاج أجنة خضرية، وكذا فإن المبيض يعطى أنسجة تكون فيها العديد من المراحل التكوينية والتي يحتاجها التكشف الجنيني في خلال نموه.

وقد أمكن إنتاج کالوس ونباتات من العديد من الأنسجة مثل الأندوسبرم Nito and Iwamaso1990. والأكياس الجنينية وكذا من المتوك ,Chaturvedi and Sharma 1985 ومن أجزاء من الساق (1975 ,Chatarvedi and Mitra). وتكشف النباتات من الأكياس الجنينية والبويضات والبذور، كما أمكن نقل العوامل الوراثية الموجودة في مختلف الكيميرات والتي لم يكن ممكنا نقلها من قبل.

استخدام البوتوبلاست في التحسين الوراثي:

لاحظ (1985 ,Navarro et al) العديد من التباينات في داخل السلالة الخضرية Somaclonal في أشجار الموالح (الناتجة من كالوس نیوسيلي)، ولكن أوضح كلا من (1988 , Kobayashi, 1987, Vardi & Galun) أن هذه التباينات تبدو نادرة الحدوث، وقد أمكن انتخاب خلايا مقاومة للأملاح بواسطة 1982 Koshba, et al1985 ,Ben Haeim, &Spiegel-Roy وقد تم تكشف نبتات Plantlets من هذه الخلايا ولكن لم يكن لها سلاميات ولم يمكن إكثارها (1989 ,Ben Haeim and Goffer).

ومن مزارع كالوس الليمون الأضاليا C.limon تم انتخاب بعض المنتخبات المقاومة للسموم الناتجة من Nadel and Spiegel - Roy, 1987). Mal secco). وقد احتفظت أحد المنتخبات بهذه المقاومة بعد ثلاث نقلات على بيئة غير متخصصة للانتخاب، ولم يذكر أي شيء عن تقييم النباتات الناتجة من ذلك. ومن الناحية الأخرى فقد أوضح (1986 ,Gardi et al) عندما أضاف الراشح من مزارع فطر الفيتو فثورا Citrophthora إلى مزرعة من الخلايا لم يتمكن من انتخاب أي مقاومة لهذا الفطر.

وهناك جهود عديدة في معاهد متفرقة على المستوى العالمي لمحاولة إدخال صفة المقاومة للأمراض والحشرات والآفات إلى التركيب الوراثي للموالح.

وقد أنتج معظم الأنواع المهمة تجاريا من استخدام البروتوبلاست ومن سوء الحظ أن إعادة تكشف البروتوبلاست إلى نبات كامل كانت صعبة بدرجة كبيرة لكي يمكن تطبيقها على عدد كبير من الأصناف، وفي معظم الأحيان كانت تتم زراعة البروتوبلاست من أنسجة المبيض، ولكن أمكن أيضا زراعة بروتوبلاست من الأوراق وتكونت نبتات من هذه المزارع 1990 ,.Tusa et al. وقد ذكر العديد من المجاميع والتي تم استخدامها في إجراء تهجينات خضرية في الموالح (تزاوج بروتوبلاست) وفي الأجناس القريبة منها.

وقد شملت الاستراتيجية العامة للتهجينات الخضرية استخدام PEG كمشجع التزاوج البروتوبلاست من الكالوس الجنيني مع البروتوبلاست المفصولة من خلايا الورقة (غير جنيني) أو البادرة (غير جنيني).

وفي بعض الأحوال فإن أغلب أو كل النباتات المتكونة تكون هجن خضرية، وعندما لا تكون هذه هي الحالة فإن الهجن المتباعدة يمكن انتخابها بالنظر مباشرة (1990 ,Grosser and Gmitter) أو الزراعة على بيئة تضمن إنتاج أجنة خضرية في الآباء التي لم يتم اندماجها (1985 ,Ohguara et al)، وحدوث التهجين ثم إثباته عن طريق العد الكروموزومي واختبارات الأيزوزومات والمظاهر المورفولوجية وتحليل ال DNA. وقد تم إنتاج العديد من الهجن بين الأجناس المختلفة التي تشمل ,Poncirus Severinia, Citropsis, Citrus, Fortunella ثم إنتاجها عن طريق الهجن الخضرية. لذلك فهذه التقنية تجعل هناك أمل في زيادة القاعدة الوراثية التي يمكن أن يستخدمها المربي في الموالح. فمثلا Severinia من المعروف أنها منيعة للإصابة بنيماتودا الموالح وهي مقاومة في نفس الوقت للتصمغ. ولا زالت في مرحلة تقييم الهجن عن طريق الاختبارات الحقلية.

وتعطى هذه الوسيلة (تزاوج البروتوبلاست) إنتاج نباتات رباعية وتستخدم لإنتاج نباتات ثلاثية عديمة البذور. واستخدام الهجن الخضرية كأب هجيني لازال غير محدد ويتأثر بالعديد من العوامل منها تزاوج الكروموزومات والسلوك في الانقسام الميوزي ومحتوى الجينوم وبرامج التربية الإضافية على مستوى النبات الرباعي وهذا يكون معقدا نظرا لأن هذه النباتات تكون عقيمة.

وقد تم إنتاج الهجن Cybrids وهي الهجن التي يتم فيها استبدال التركيب الوراثي في الميتوكوندريا في أحد الأنواع بتركيب وراثي آخر من نوع آخر. وقد تم إجراء ذلك في الموالح والأجناس القريبة منها (1987 ,Verdi et al).

ويمكن استخدام تقنية إنقاذ الأجنة للحصول على أجنة ثلاثية المجموعة الكروموزومية (4نx 2ن ← 3ن) حيث تكون 2ن المستخدمة كأم (♀) وحيدة الجنين (1982 Recupero,Starrantino and). وهناك تقارير عن إنتاج نباتات من مزارع المتوك في البرتقال الثلاثي الأوراق (1979 ,Hidaka et al) والموالح Hidaka et ,1982 ,Chaturvedi and Sharma , 1985) al) وقد تحصل في حالة البرتقال الثلاثي الأوراق فقط على نباتات أحادية. وفي Citrus madurensis أظهرت تحليلات الأيزوزومات أن النباتات الثنائية نشأت من الأنسجة الأمية (1988 ,Ling et al).

التعديل الجيني: Gene Transformation:

أمكن تعديل البروتوبلاست في البرتقال عن طريق عامل وراثي معلم Marker gene لأجل مقاومة الكاناميسين Kanamycin عن طريق الإدخال المباشر في الDNA وتواجد العامل الوراثي الدخيل Foreign قد تم تأكيده عن طريق Southern Kobayashi and Uchimiya, 1989) hybridization). وقد تم إنتاج نبتات من الموالح المعدلة وراثية ثلاثية المجموعة بواسطة كلا من:

1- أدخل (1990 ,Vardi et al) العامل الوراثي Marker gene في بروتوبلاست الليمون المخرفش باستخدام PEG والإدخال المباشر في DNA ونتج من ذلك نبتتين تكون عليهم جذور وكانت محتويه على العامل الوراثي المذكور وقد تم تأكيد ذلك عن طريق Southern hybridization.

2- أجرى (1990, Hidaka et al) تعديل وراثي على مزرعة أنسجة لخلايا كالوس معلقة من البرتقال الحلو الجنيني باستخدام بلازميد الأجروباکتریم Agrabacterium plasmid وتحصل على الأقل على نبتة Plantlet واحدة يظهر فيها العامل الوراثي المستخدم Marker gene.

 3- أجرى (1991, Gmitter et al) تعديل وراثي لجزء من الساق من الكاريزو سترانج باستخدام الأجروباکتریم.

وكانت كفاءة جميع هذه الطرق قليلة ولكنها من المتوقع أن تزيد مع الوقت وهناك إمكانيات لتعديل العديد من الصفات عن طريق تقنيات التعديل الوراثي. وتبذل جهودا لإنتاج سلالات موالح مقاومة لمرض التريستيزا بواسطة التعديل الوراثي لهذه السلالات وذلك عن طريق استخدام عوامل وراثية معينة لمقاومة التدهور السريع. وقد تستخدم تقنية Antisense لتعديل بعض المواصفات للثمار أو بعض المواصفات الأخرى. إلا أن التعديل الوراثي بهدف مقاومة مبيدات الحشائش ليست من الأهداف الرئيسية البرامج التربية الحالية.

تعريف العامل الوراثي: Gene Characterization

كانت العوامل الوراثية للموالح التي تم فصلها وتكرارها Cloned & isolated هي المتعلقة ببناء DNA فقط (1986 ,Kolasha and Fodor). وجينوم الموالح يعتبر من بين أصغر التراكيب الوراثية المعروفة بين النباتات العليا (الجينوم الأحادي يمثل 61 - 0) Guerra, 1984) Pg) وعلى ذلك فإن فصل عوامل وراثية محددة ستكون سهلة إذا ما توفرت التقنيات اللازمة Probes. وهناك جهودا لتعريف وتكرار Clone العوامل الوراثية المختلفة في التركيب الوراثي للموالح. ويعتبر عدم توفر المعلومات عن طريقة توريث العوامل الهامة في الموالح من العوامل المحددة لتوصيف وتكرار Cloning & Charecterization العديد من الصفات الهامة في الموالح.