ميكروبات الاندوفايت
مقدمة:
ازداد الاهتمام منذ بداية الألفية الثالثة باستخدام الطرق المستدامة لمكافحة الآفات والأمراض - مثل برامج المكافحة البيولوجية - بشكل ملفت للنظر، وقد تمثل هذا الاهتمام المتزايد في البحث عن بدائل حيوية لمبيدات الآفات الكيميائية والتي فقد كثير منها فعالياته على أثر ظهور أجيال من الآفات والميكروبات الممرضة المقاومة للمبيدات الكيميائية، إلى جانب الضغط الدائم للرأي العام لتطوير نظم إنتاج زراعية صديقة للبيئة، حيث أدى دخول مبيدات الآفات الكيميائية في السلسلة الغذائية food chain إلى ظهور العديد من المخاطر للكائنات الحية في النظم البيئية المختلفة ومنها الإضرار بصحة الإنسان والحيوانات.
وفي السنوات الماضية زاد الاهتمام باستخدام الريزوبكتيريا والريزوفطريات في المكافحة الحيوية للميكروبات الممرضة كما أسلفنا، إلا أن الدراسات أظهرت أيضًا أن الكائنات داخلية المعيشة بالنباتات الحية والتي يطلق عليها مسمى «الاندوفايت endophytes» - والتي اكتشفت لأول مرة عام 1926 - تحسن من نمو وصحة النبات وتلعب دورًا هامًا في المكافحة الحيوية لكثير من الميكروبات الممرضة للنبات، ولذلك تعتبر بكتيريات وفطريات الاندوفايت إلى جانب أشكال أخرى تشبه الفيروسات أحد البدائل الخضراء الهامة بيئيا في الوقت الراهن في وقاية النباتات من كثير من الميكروبات المسببة للأمراض، ويزداد استخدامها حاليًا في تلقيح كثير من النباتات الاقتصادية لوقايتها من كثير من الميكروبات الممرضة للنبات.
ويبلغ عدد أنواع النباتات على سطح الأرض حوالي 300,000 نوع، ويمثل كل نوع بمفرده عائل واحد أو أكثر من ميكروبات الاندوفايت، ومعظم ميكروبات الاندوفايت المعزولة عبارة عن فطريات، ويقدر عدد فطريات الاندوفايت وحدها بحوالي مليون نوع، وقد تم عزلها من جميع النباتات الوعائية التي تم فحصها.
* ماهية ميكروبات الاندوفايت؟
تعني كلمة «اندوفايت endophyte» بشكلها الحرفي «في النبات in the plant»، وقد تم إدخال هذا المصطلح بواسطة De Bary منذ فترة طويلة، ويستعمل هذا المصطلح بشكل أوسع ليشمل البكتيريا والفطريات وغيرها من الكائنات داخلية المعيشة بالنباتات، وهي أنواع ميكروبية غير ضارة تعيش بداخل أنسجة النبات فترة كبيرة من دورة حياتها دون أن تضر، أو تسبب له أي مرض، وبعض ميكروبات الاندوفايت إجباري المعيشة الداخلية بالنبات إذ لا يستطيع النمو بالتربة خارج النبات، والبعض الآخر اختياري المعيشة الداخلية بالنبات حيث يتواجد وينمو بداخل النبات العائل أو بالتربة.
ويعيش الكثير من أنواع البكتيريا السالبة والموجبة لصيغ جرام، والمتجرّثمة وغير المتجرّثمة في أنسجة الكثير من النباتات وبصفة رئيسية في الفراغات بين خلايا النبات وبداخل الأنسجة الوعائية دون الإضرار بالنبات مع الإمداد بالمنفعة للقاطنات الميكروبية الأخرى.
وكذلك يعيش كثير من الفطريات بداخل خلايا الأنسجة النباتية كما هو الحال في الفطريات التي تعيش بسيقان وأوراق وجذور عوائلها النباتية بشكل مكثف حيث تنتج كثير من المواد الطبيعية ذات التأثير التضادي للبكتيريا والفطريات، وتعيش هذه الفطريات تقريبًا في كل أنواع النباتات الراقية والطحالب التي تم دراستها دون إظهار لأعراض إصابة يمكن رؤيتها (شكل 1).
شكل (1) أحد فطريات الاندوفايت نامي على ورقة نبات.
وتمثل العلاقة بين الميكروبات داخلية المعيشة بالنبات والنبات العائل حالة تعايش مفيدة لكلا الطرفين، إذ يمد النبات ميكروبات الاندوفايت بالمواد الغذائية ويقيها من الظروف البيئية بالإضافة إلى ميزات أخرى كالتكاثر والاستيطان وفي المقابل تلعب ميكروبات الاندوفايت أدوارًا هامة في تغذية النبات العائل بمواد النمو التي تفرزها مثل اندول حامض الخليك والنيتروجين الذي تثبت أفرادها مثل عائلة الرايزوبيوم Rhizobiaceae وجنس هرباسبيريلم Herbaspirillum وجنس آزواركس Azoarcus والنيتروجين الذي تزيد من امتصاصه في الأراضي الفقيرة في النيتروجين، وفي هدم الملوثات ( مثل جنس سيدوموناس Pseudomonas )، والاستجابة الدفاعية، وغزو الممرضات، وإنتاج المواد الأيضية المضادة للميكروبات الممرضة للنبات، وتقليل إصابة النباتات بالنيماتودا، وإنتاج مركبات الألكالديدات alkaloids السامة للحشرات.
* الصادر ومنافذ الدخول:
هناك مصادر متعددة لميكروبات الاندوفايت أهمها على الإطلاق تربة منطقة المحيط الجذري للنباتات، كما تعتبر الأجزاء التكاثرية النباتية كحبوب الغلال وبذور المحاصيل المختلفة ودرنات البطاطس وثمار الخضروات وجذور وسيقان النباتات مصدر لهذه البكتيريا.
وتصل ميكروبات الاندوفايت إلى الأنسجة الداخلية للنباتات من أكثر من منفذ أهمها الجروح المعتادة الحدوث بالنباتات بسبب استطالة الجذور واختراق التربة، وعمليات الخدمة التقليدية، والإصابات الفطرية وغيرها، كما تنفذ هذه البكتيريا إلى الأنسجة الداخلية للنبات من الثغور والعدسات ومناطق نمو الشعيرات الجذرية الجانبية، وتفرز بعض ميكروبات الاندوفايت نظم إنزيمية محللة للجدر الخلوية مثل السليوليز والهيميسليليز والبكتينيز.
وتبدأ مراحل تطور التفاعل بين ميكروبات الاندوفايت والنبات بالاتصال والارتباط بسطح النبات، ثم العدوى والاحتلال، والاستيطان بداخل أنسجة النبات، والتكاثر ( بما فيه التجرثم )، وظهور الخصائص المظهرية المختلفة، وأخيرًا الانتشار إلى الأفراد النباتية الأخرى ( شكل 2 ).
شكل (2) الارتباط والاستيطان المبكر لسلالة الأندوفايت Pseudomonas putida WCS358 بسط جذر نبات الطماطم.
* أماكن التواجد بالنبات:
تستوطن ميكروبات الاندوفايت بعض الأماكن بداخل النبات مثل المسافات البينية بين خلايا البشرة والقشرة (شكل 3) في الجذور والسيقان، والأوعية الناقلة في جذور النبات، ويتحدد مكان الاستيطان على حسب النوع النباتي، ويحمل العصير النباتي بكتيريا الاندوفايت من الجذور إلى السيقان أو بالعكس.
وتؤثر بعض العوامل الحيوية وغير الحيوية على كفاءة بكتيريا الاندوفايت في الولوج إلى النبات والتواجد بداخله، وتعتبر الكائنات الحية الدقيقة المتعايشة مع النبات وما ينشأ بينها من علاقات من أهم العوامل الحيوية المؤثرة إذ تلعب دورًا هامًا في تشجيع وعدم تشجيع بكتيريا الاندوفايت على الدخول إلى النبات واستيطانه، كذلك تساعد إصابة النبات بالنيماتودا على توفير منافذ لدخول بكتيريا الاندوفايت إلى النبات من خلال الثقوب النباتية الناتجة عن الإصابة بالنيماتودا ومن ثم تؤدي إلى زيادة أعداد بكتيريا الاندوفايت.
شكل (3) قطاع عرضي في خلايا قشرة جذر ابتدائي يوضح نمو الهيفات في الفراغات بين الخلايا
ومن ناحية أخرى تشمل العوامل غير الحيوية خصائص التربة الفيزيائية والكيميائية والتي تؤثر بدورها على بكتيريا التربة ومنها بكتيريا المحيط الجذري، ومن ثم تحديد أنواع البكتيريا التي تلج إلى النبات العائل وتقطنه.
وتعتمد نسبة الميكروبات داخلية المعيشة بالنباتات ذات التأثير التضادي على عدة عوامل منها الموطن، والنوع النباتي، والإصابة بالميكروبات الممرضة، وفترة النمو الخضري.
ويؤثر كثير من العوامل الحيوية على مجتمع میكروبات الاندوفايت ونسبة الميكروبات ذات التأثير الهام في مجال المكافحة الحيوية، ومن هذه العوامل:
1. النبات نفسه حيث يؤثر الطراز الوراثي للنبات على تنوع ميكروبات الاندوفايت.
2. حالة النبات النامي أي ما إذا كان النبات ينمو بحالة ضعيفة أو جيدة.
3. ضغط الميكروب الممرض.
أما التذبذب في المجتمعات الميكروبية الداخلية المعيشة بالنباتات ذات التأثير التضادي والنامية بجذور النبات فقد ينشأ عن عوامل غير حيوية مثل سقوط الأمطار ودرجة الحرارة والممارسات الزراعية والإضافات التي تتم للتربة والتي يمكن أن تعدل في الأنواع البكتيرية في التربة وفى الجذور كما يمكنها أن تحسن كفاءة عوامل المكافحة الحيوية.
ويوضح جدول (1) أهم أنواع البكتيريا داخلية المعيشة بالنباتات ذات التأثير التضادي للفطريات الممرضة للنبات والتي تم تعريفها بنبات البطاطس من خلال العديد من الدراسات.
ومن أمثلة فطريات الإندوفايت جنس کولیتوتريكم Colletotrichum وجنس فوموبسیس Phomopsis وجنس فيلوستيكتا Phyllosticta والنوع اكريمونيم ستريكتم Acremonium strictum والنوع فیوزاريم أوکسیسبورم Fusarium oxysporum.
* عزل ميكروبات الإندوفايت:
يتم عزل ميكروبات الإندوفايت بغرض توصيفها لاستخدامها في أغراض كثيرة كالمكافحة الحيوية، ويجب أن تكون طريقة العزل دقيقة وحساسة بما فيه الكفاية لضمان نجاحها، ومن الناحية العملية يلاحظ أن عزل ميكروبات الإندوفايت من الصعوبة بمكان نظراً لطبيعة تواجدها، ويتم عزل بكتيريا وفطريات الإندوفايت من النبات العائل بعدة طرق، وذلك بعد إجراء التعقيم السطحي للجزء النباتي المطلوب العزل منه، وذلك باستخدام الكثير من المواد الكيميائية الشائعة مثل هيبو كلوريت الصوديوم والكحول وبيروكسيد الهيدروجين، ثم غسيله عدة مرات بماء معقم.
ومن أكثر الطرق المستخدمة شيوعًا هي طحن الجزء النباتي السابق تعقيمه سطحيًا في هاون مع ماء معقم، وزرع النسيج أو سائل الجزء النباتي المعقم على وسط مغذى، كما قد يتم عزل بكتيريا الإندوفايت من الأوعية الناقلة بالنبات، باستخلاص السائل الموجود بتلك الأوعية، بالتفريغ أو بالضغط، ثم يخفف السائل الناتج، وينمي على بيئات الزرع الملائمة لإجراء العزل والتنقية والتعريف والتطبيق.
جدول (2) بعض أنواع بكتيريا الأندوفايت ذات التأثير التضادي للفطريات المعزولة من نبات البطاطس.
* آليات ميكروبات الاندوفايت في المكافحة الحيوية:
تلعب الميكروبات داخلية المعيشة بالنباتات دورًا هامًا في المكافحة الحيوية لكثير من الأمراض النباتية كما هو الحال في مرض العفن الفحمي في فول الصويا الذي يسببه فطر ريزوكتونيا باتاتيكولا Rhizoctonia bataticola (Taub) Butler، ومرض الذبول في القطن الحادث بواسطة فطر الفيوزاريم اوكسيسبورم Fusarium oxysporum f. sp. .vasinfectum
وتمتلك كثير من بكتيريا الاندوفايت نشاط تضادي لكثير من الفطريات الممرضة مثل فطر فيرتسليم داهليا Verticillium dahliae، وفطر ريزوكتونيا سولاني Rhizoctonia solani في البطاطس، وفطر سكويروتيم رولفسياني Sclerotium rolfsii في الفول وغيرها كثير، فإلى جانب ما تنتجه هذه البكتيريا من مواد النمو growth substances للنبات والتي تعتبر أساسية في تطوير البريوفيت bryophyte، وما تثبته من النيتروجين الجزيئي، وما تزيده من إتاحة للعناصر الغذائية الهامة، فإنها تفرز مواد مضادة لكثير من مسببات أمراض النبات.
ويقاوم فطر الاندوفايت البازيدي الذي يشبه الميكوريزا بيريفورموسبورا انديكا Piriformospora indica كثير من الفطريات الممرضة مثل فطر الترناريا سولاني Alternaria solani (شكل 4)، ولهذا الفطر أهمية كبيرة فهو أحد نظم التسميد الحيوي، كما أنه بمثابة واقى للنباتات، ومحث لنمو النبات، ومبيد حيوي للحشائش.
وتكافح كثير من ميكروبات الاندوفايت كالفطريات النيماتودا المتطفلة على النباتات (جدول 3) و (شكل 5).
ومن الآليات المستخدمة بواسطة ميكروبات الاندوفايت في المكافحة الحيوية حث المقاومة لدى النباتات، والتضاد الحيوي، والتنافس، والتحليل، وهي آليات مشابهة لتلك التي تستخدمها الريزوبكتيريا.
شكل (4) تفاعل فطر الاندوفايت مع فطر الترناريا سولاني
جدول (3) بعض فطريات الاندوفايت المستخدمة في المكافحة الحيوية للنيماتودا على المحاصيل.
شكل (5) الفطر البازيدي صائد النيماتودا Nematoctonus robustus على جذور الشعير ويلاحظ clamp- connection (arrow)
1- التضاد الحيوي:
يقصد به قدرة ميكروبات الاندوفايت على تثبيط نمو الميكروبات الممرضة بما تنتجه من مضادات حيوية أو سموم، وفي الحقيقة فإن معظم أفراد ميكروبات الاندوفايت له نشاط مضاد للميكروبات الممرضة في الاختبارات المعملية in vitro، إلا أن أهمية التضاد الحيوي للكائنات الممرضة بداخل نسيج الجذر مازال يكتنفه كثير من الغموض، ومن أمثلة المواد المضادة التي تطلقها بكتيريا الاندوفايت مادة اتيورين أ iturin A التي تنتجها بكتيريا باسيلس ستلس Bacillus subtilis ومادة بيرورولنيترين pyrorolnitrin التي تنتجها بكتيريا سيرتيا بلايميوثيكا Serratia plymuthica.
وتختلف استجابة الميكروبات الممرضة لآلية التضاد الحيوي، وتشمل الاستجابة مقاومة المضادات الحيوية، والتدفق النشيط للمضادات الحيوية، وإبطال السمية، وقمع جينات تخليق البروتينات المشاركة في عملية المكافحة الحيوية.
2- التنافس:
يعتبر التنافس آلية هامة توظفها ميكروبات الاندوفايت في مكافحة الميكروبات الممرضة، مرجع ذلك أن كلا من ميكروبات الاندوفايت والميكروبات الممرضة تقطن نفس المكان، وتستعمل نفس المواد الغذائية، وفي الظروف التي يكون فيها عنصر الحديد محدوداً تنتج بكتيريا الريزوسفير حوامل الحديد siderophores التي تجتذب الحديديك حيث تحرم منه الفطريات الممرضة ومن ثم تحد من نموها، كما تنتج بكتيريا الاندوفايت الـ derophores مما يدل على حدوث آليات مشابهة في الاندوريزا endorhiza.
ومن أمثلة فطريات الإندوفايت التي تستخدم آلية التنافس فطر فيالوفورا جرامينيكولا Phialophora graminicola الذي يتنافس مع الفطر الممرض جايومانوميسيس جرامينيس Gaeumanomyces graminis على المكان والمواد الغذائية ومن ثم يقلل من فرصة نمو الفطر الأخير، كذلك يقلل هذا الفطر من الكربون المتاح للفطر الممرض، كما يكون عوائق ميكانيكية تنتج من زيادة سمك الاندودرمس الذي يثبط استيطان الفطر الممرض.
3- تحلل الجدر الخلوية:
تستخدم ميكروبات الاندوفايت آلية تحلل الجدر الخلوية لمكافحة الميكروبات الممرضة، وتفرز بكتيريا الاندوفايت إنزيمات محللة مثل السليوليز والكيتنيز والجلوكانيز، فمثلًا تفرز بكتيريا الاندوفايت اكتينوبلانيز ميسوبورينسي Actinoplanes missouriensis انزيم الكيتنيز الذي يثبط فطر بلكتوسبوريم تاباسينم Plectosporium tabacinum في الترمس، كذلك تساعد سلالات بكتيريا باسيلس ستلس Bacillus subtilis المنتجة لإنزيم الكيتنيز في تقليل الإصابة بفطر فيرتيسيليم داهليا Verticillium dahliae في كثير من النباتات.
4 - حث آليات دفاعات النبات:
تحث ميكروبات الاندوفايت آليات الدفاع لدى النبات، وذلك بتكوين حواجز ميكانيكية، وزيادة سمك الجدر الخلوية، وتلعب عملية الحث هذه دوراً رئيسياً في تثبيط الميكروبات الممرضة للنبات.
ومن السلالات البكتيرية التي درست بكثرة ولها تأثير كبير في حث دفاعات النباتات ما يلي:
Bacillus amyloliquefaciens IN937a.
B. subtilis IN937b.
B. pumilus SE34.
B. pumilus INR7.
Pseudomonas fluorescens 89B-61.
P. fluorescens CHA0.
Serratia marcescens 90- 166.
5 - نمو النبات:
يساهم النمو الجيد للنبات بشكل غير مباشر في دفاعاته، فالنباتات ذات النمو القوي بمقدورها مقاومة الأمراض كالبياض الدقيقي، ولذلك فإن تشجيع نمو النبات بواسطة بكتيريا الاندوفايت يؤثر بشكل غير مباشر على مرضية الميكروبات، وتشجيع بكتيريا الاندوفايت من إنبات البذور عن طريق إفراز مواد النمو النباتية مثل الأكسينات auxins والسيتوكينينات cytokinins، وتحقيق حوامل الحديد، وتثبيت النيتروجين الجوي، وإذابة الفوسفات، أو من خلال الأنشطة الإنزيمية مثل تثبيط الاثيلين بواسطة إنزيم 1- aminocyclopropane- 1-carboxylate (ACC) deaminase
* الاستخدامات التطبيقية لميكروبات الاندوفايت في المكافحة الحيوية:
يستطيع عدد كبير من ميكروبات الاندوفيت مكافحة الميكروبات الممرضة للنباتات الأخرى، وتشمل بكتيريا الاندوفايت أنواع عديدة من جنس سيدوموناس Pseudomonas وجنس باسيلس Bacillus وجنس بانيباسيلس Paenibacillus إلى جانب أنواع من أجناس أخرى مثل سيراتيا بلايميوثيكا Serratia plymuthica وسفينجوموناس توروبيرى Sphingomonas trueperi وفيلوبكتيريم Phyllobacterium وبركهولديريا سولاناسيرم Burkholderia solanacearum.
وتستخدم لقاحات الاندوفايت في تلقيح الكثير من النباتات لتحسين نمو وصحة هذه النباتات ووقايتها من كثير من الميكروبات الممرضة لها، حيث تحث ميكروبات الاندوفايت آليات الدفاع لدى النبات، وتلعب عملية الحث هذه دوراً رئيسياً في تثبيط الميكروبات الممرضة للنبات.
وتستعمل سلالة بكتيريا الاندوفايت Pseudomonas trivialis 3 Re207 في مكافحة الإصابة بفطر رايزوكتونيا سولاني Rhizoctonia solani في بعض النباتات مثل بنجر السكر والخس.
ويستخدم كثير من اكتينوميسيتات الاندوفايت من أجناس ستربتوميسيس Streptomyces وميكروبايسبورا Microbispora ونوكارديوايدس Nocardioides في المكافحة الحيوية، فعلى سبيل المثال يستخدم النوع اكتينوبلانس ميسويورينسيس Actinoplanes missouriensis في مكافحة بليكتوسبوريم تاباسينم Plectosporium tabacinum المسبب المرضى لعفن الجذور في الترمس.
* تحسين كفاءة ميكروبات الاندوفايت في المكافحة الحيوية:
يساعد تحسين كفاءة ميكروبات الاندوفايت على نجاحها كأدوات للمكافحة الحيوية، وفيما يلي الاستراتيجيات الحالية لتحسين كفاءة عوامل المكافحة الحيوية:
1- استخدام تقنيات مثالية لتجهيز المستحضرات وتطبيقها.
2- استراتيجيات المكافحة الحيوية المتكاملة.
3- المكافحة الحيوية بميكروبات الاندوفايت التي تقطن النباتات Indigenous.
4- الهندسة الوراثية.
ويفضل نوعين من المستحضرات في حالة ميكروبات الاندوفايت هما المنتجات الجافة والمعلقات السائلة liquid suspensions، ويتوفر بالأسواق مستحضرات جافة يمكن تخزينها لفترة طويلة من بكتيريا الاندوفايت الموجبة لجرام، إلا أن الأمر يختلف في حالة البكتيريا السالبة لجرام بسبب عدم تكوينها للجراثيم التي يمكن تخزينها بثبات في المستحضرات، ومستحضر ميكروبات الاندوفايت المثالي هو الذي يضمن بقاء الميكروبات به حية، ويساعد النشاط الميكروبي عند استخدامه بشكل تطبيقي.
وهناك العديد من الطرق لاستخدام لقاحات ميكروبات الاندوفايت مثل:
- تلقيح السيقان.
- نقع البذرة في المعلقات.
- إضافة جرعة للتربة الزراعية.
- تغليف البذور بالميثيل سليلوز.
- الرش الورقي.
- تسكين الميكروبات على صورة خرز.
- غمس الجذور في المعلقات.
ويتحكم في عملية المكافحة الحيوية عن طريق استخدام الميكروبات داخلية المعيشة بالنبات والمتواجدة طبيعيًا بعض العوامل الحيوية وغير الحيوية والتي يؤدي تغييرها إلى التحكم في عملية المكافحة الحيوية، فاستخدام الكيتين يزيد أعداد بكتيريا بركهولدريا سيبسيا Burkholderia cepacia ويحسن من مكافحة بكتيريا الاندوفايت من النوعين باسيلس ستلس Bacillus subtilis وباسيلس ليشينيفورميس B. licheniformis لمرض عفن الجذور في نباتات الفلفل، كما يحسن استخدام بوليمر الكيتوزان في حالة بكتيريا الاندوفايت باسيلس بيوميلس B. pumilus من مقاومة النباتات كالطماطم تجاه ذبول الفيوزاريم Fusarium، ويعمل كل من الكيتين والكيتوزان على تنشيط الميكروبات المحللة للكيتين بالجدار الخلوية للفطريات الممرضة.
ومن ناحية أخرى، يتم تطوير كفاءة المكافحة الحيوية بتربية نباتات تدعم مستوى عالي من ميكروبات الاندوفايت الهامة في مجال المكافحة الحيوية، ومن أهداف المكافحة الحيوية الهندسة الوراثية للعوامل المنظمة للجين بميكروبات الاندوفايت مثل طريقة عملها، والقدرة الاستيطانية، والبقاء، والملائمة، والتأقلم مع الظروف البيئية، وبالفعل فقد أجرى البعض تعديلًا وراثيًا لبعض بكتيريا الاندوفايت كالنوع سيدوموناس فلورينسس Pseudomonas fluorescens بنقل الجين الخاص بإنتاج إنزيم الكيتينيز إليه من بكتيريا سيرتيا مارسيسنس Serratia marcescens.
