بعد الحصول على المادة الوراثية الحاوية على الجين المرغوب وبنقاوة عالية، نحتاج الآن الى عزل ذلك الجين عن بقية المادة الوراثية للخلية الواهبة. ولأجل ذلك، لابد من توفر وسيلة تقوم "بقص" ذلك الجين من طرفيه .ربما كان مجرد التفكير بوجود انزيمات معينة يمكن لها أن تعمل "كمقصات خلوية" لقطعة الجين المرغوبة شيئاً من الخيال.

بدأ هذا الخيال يتحول الى واقع في الخمسينيات من القرن المنصرم بملاحظة أن بكتريا القولون يمكنها أن تقاوم بطريقة ما خمج العاثيات البكتيرية عن طريق "تقييد" (أي تثبيط) تضاعف العاثي الغازي. وفي العام 1962 وجد العالم Werner Arber وجماعته نظام انزيمي يمكن له تثبيط تضاعف العاثي عن طريق شق DNA العاثي حال دخوله الخلية. قام هذا الفريق البحثي بعزل هذا الانزيم من خلايا بكتريا القولون واعتبروه انزيما هاضما. ولا بد من معرفة أن هنالك عدة أنواع من الانزيمات الهاضمة للأحماض النووية، فأنزيمات الـ RNases تقوم بمهاجمة الـ RNA، بينما تقوم انزيمات الـ DNases بمهاجمة الـ DNA .وهنالك نوع من التخصص عموماً في عمل تلك الانزيمات الهاضمة، فبعضها يهاجم الأحماض النووية مفردة الشريط فقط، وتقوم الانزيمات الأخرى بمهاجمة الأحماض النووية مزدوجة الشريط، بينما تقوم نسبة قليلة فقط بمهاجمة كلا النوعين. تقوم الانزيمات الهاضمة الخارجية (exonucleases) بمهاجمة جزيئة الحمض النووي من نهايتها. ومن الجدير بالذكر أن أي نوع من الانزيمات الهاضمة الخارجية يقوم بمهاجمة احدى نهايتي جزيئة الحمض النووي، أما النهاية 3' أو النهاية 5' ، وليس كلتيهما. وعلى الرغم من ان الانزيمات المكتشفة من قبل Arber وجماعته هي انزيمات هاضمة أيضاً، الا انها لاتهضم جزيئة الحمض النووي من الجزء الطرفي، بل تقوم "بشق" جزيئة الحمض النووي داخلياً، وبالتالي اعتبر هذا الانزيم انزيما هاضما داخليا (endonucleases)، لأن هذا الانزيم يشق (cleave) الأحماض النووية، وبالطبع تحدث عملية "الشق" ضمن جزيئة الـ DNA .وفي حالة الاصابة بالعاثيات البكتيرية، تقوم انزيمات بكتريا القولون الداخلية تلك بشق DNA العاثي الغازي ولكنها لا تقطع DNA العائل البكتيري. تعتبر عملية "التقييد" تلك جزاً مما نعرفه الآن بنظام التقييد - التحوير البكتيري  ( bacterial restriction -  modification system) ، والذي يحمي البكتريا من خمج العاثيات عن طريق التمييز بين DNA العائل والـ DNA الغريب. وهذا يعني، أن كل الـ DNA البكتيري، ومن ضمنه DNA البلازميد هو DNA يتم حمايته عادة من قبل الميثلة ان السبب الذي من أجله سميت هذه الإنزيمات بإنزيمات التقييد restriction enzymes هو أن وجودها في البكتريا يقيد نمو العاثيات البكتيرية (bacteriophages) .اذن وظيفتها التي وجدت من أجلها في الطبيعة تتمثل بحماية العائل البكتيري من DNA الكائنات الحية الغريبة (كما في العاثيات الخامجة (infective phages فهي بذلك تعتبر إنزيمات دفاعية .(defensive enzymes) وهنا لابد لنا من أن نسأل هذا السؤال: اذا واجه نظام التقييد - التحوير الحاوي على انزيمات ميثلة مزدوجة مع انزيمات التقطيع، شريطي DNA غير مميثلين أحدهما خلوي والآخر غريب، فكيف يتسنى له التفريق بينهما بحيث يحور الأول ويقطع الثاني؟

 للإجابة على هذا السؤال لابد لنا من معرفة أن هذا النظام أي نظام التقييد - التحوير، ينتج تعقيدات اضافية على عملية تضاعف الـ DNA والتي لم تذكر في الفصل الثالث وذلك لغرض التبسيط يحتوي الـ DNA مزدوج الشريط الخلوي على مجاميع مثيل على كلا شريطي الـ DNA في موقع تمييز الانزيم القاطع. وعندما يخلق التضاعف شريطين جديدين، يفتقد هنا أحد الشريطين في كل حلزون مزدوج بنوي لمجاميع المثيل في البداية. ان هذا الـ DNA النصف مميثل يجب أن لا يميز من قبل الخلية كـ "DNA غريب" ويقطع، وانما يتم تمييزه كـ "DNA ذاتي ويحور" بواسطة نظام التقييد والتحوير باضافة المثيل (شكل 2). ولهذا السبب، يعمل نظام التقييد - التحوير هذا بشكل بحيث يميز ثلاث حالات مختلفة من ميثلة تسلسلات التمييز وتتخذ واحد من ثلاث أفعال مختلفة. فاذا كان التسلسل غير مميثل (unmethylated) ، يقوم الانزيم القاطع في نظام التقييد بقطعه. واذا كان الـ DNA مميثل في أحد شريطيه فقط hemi-methylated)، يقوم الانزيم المحور (المميثل) في نظام التحوير بإضافة مجاميع مثيل الى الشريط الآخر الغير مميثل (شكل 2). أما اذا كان الـ DNA مميثلاً في كلا شريطيه فان انزيمات نظام التقييد - التحوير لا تقوم بعمل أي شيء يذكر. وبهذه الطريقة، يعتبر هذا الواسم المثيلي كنقطة تمييز بين DNA العائل والـ DNA الغازي. وبما أن DNA بكتريا القولون هو DNA مميثل، تعتبره الانزيمات القاطعة لهذا السبب كروموسوماً أصيلاً، وتحميه من شق الانزيمات القاطعة الموجودة في الخلية. أما DNA العاثي فهو غير مميثل، فيعتبر لهذا السبب هدفا للإنزيمات القاطعة لتقييده أو لتقطيعه لتمنع بهذه الطريقة تضاعف العاثي الغازي داخل الخلية البكتيرية العائل.

شكل (2). ميثلة التسلسل التمييز البالندرومي يستوجب تمييز وميثلة تسلسلين مختلفين على أشرطة الـ DNA البنوية في تضاعف الـ DNA، يشير اللون الأسود الى الثايمين ويشير اللون الأحمر الى الأدنين (تصميم المؤلف).

 في نهاية السبعينيات من القرن المنصرم - وهي الحقبة الذهبية في تطور علم الوراثة الجزيئية - تمكن Hamilton Smith وجماعته من عزل انزيم قاطع جديد وأسموه IIIHind واشتق هذا الاسم من البكتريا التي عزل منها الانزيم وهي Haemophilus influenza. وبعد العزل، استخدمه Daniel Nathans في قطع الـ DNA الفايروسي SV40 اكتشف Smith قدرة انزيم IIIHind القاطع على قطع كل جينوم SV40 بموقع واحد فقط، حتى لو وجدت كمية كبيرة منه. ولقد دهش المجتمع العلمي أن ذاك عندما ذكر Smith بأن هذا الانزيم يقطع "بالضبط" عند نفس الموقع لكل جزيئة SV40 معرضة له. وعليه، منح كل من العلماء Arber و Smith و Nathans جائزة نوبل في الطب أو الفسلجة في عام 1978 تثميناً لذلك الانجاز. وليس هذا فحسب، بل حدث هنالك انجازان عظيمان في مجال الهندسة الوراثية، أولهما قيام Herbert Boyer بعزل الانزيم القاطع RIEco، وهو الانزيم الذي يترك نهايات لزجة بعد قطعه لقطعة الـ DNA قوبل هذا الاكتشاف بقبول واسع في الأوساط العلمية آنذاك لأن النهايات اللزجة الناجمة عن قطع ذلك الانزيم تمتاز بسهولة ارتباطها ببعضها البعض بسبب تكميل بعضها للبعض الآخر في التسلسل وهذا يسهل ارتباطها ببعضها البعض. كما كان للعالم Stanley Cohen الفضل الكبير في توافر معلومات كثيرة حول البلازميدات مكنت الباحثين من استخدامها كنواقل كلونة في المستقبل. وفي عام 1980 حصل Paul Berg على جائزة نوبل بسبب تمكنه من تخليق أول جزيئة هجينة وهي عبارة عن عاثي بكتيري يحتوي على قطعة DNA مشتقة من الفايروس SV40 .

وبعد تلك المرحلة أدرك العلماء أن تلك الانزيمات يمكن لها أن تقطع أي جزيئة DNA بصرف النظر عن مصدرها (ماعدا حماية الـ DNA عن طريق تحويره كيميائيا)، أي أنها تقطع الـ DNA إلى قطع صغيرة بنمط ذو تسلسل متخصص، وهذا يحدث بالتناقض مع معظم الطرق الإنزيمية والكيميائية والفيزيائية الأخرى التي تحطم الـ DNA بشكل عشوائي. وعلى سبيل المثال، يمكن للإنزيم القاطع IIIHind أن يشق أي جزيئة DNA تحتوي على موقع التمييز خاصته، بغض النظر عن مصدر تلك الجزيئة سواء أكانت من فايروس أو نبات أو حيوان أو حتى من البشر. ومن هنا يتضح لماذا أصبحت تلك الانزيمات القاطعة أدوات أساسية لأي نوع من البحث الجيني. وبتقادم السنين، تطور استخدام تلك الانزيمات في تجارب الهندسة الوراثية شائعاً الى الحد الذي أصبح فيه للباحث المشتغل في هذا المجال في التسعينيات من القرن المنصرم مقدار واسع من الاختيار يصل الى الآلاف الانزيمات القاطعة ذات النقاوة العالية والمتوفرة تجارياً لقطع جزيئته في أي موقع مرغوب. وقبل أن يصل العدد الى هذا الحد، قام الباحثون بإيجاد طريقة ناجعة لتجنب الارباك في تسميتها، حيث اشتقت تلك التسمية من أسم البكتريا التي عزل منها الانزيم القاطع. وعلى سبيل المثال، إنزيم RIEcoمن بكتريا القولون Escherichia coli، وإنزيم Bam HI من بكتريا Bacillus amyloliquefaciens (جدول 1). إن الحروف الثلاث الأولى في اسم إنزيم التقييد تتألف من الحرف الأول والذي يشتق من الحرف الأول من اسم الجنس (E)، والحرف الثاني والذي يشتق من أول حرفين لاسم النوع (co). ربما تتبع هذه باسم السلالة (R) والعدد الروماني (I) للإشارة إلى تسلسل الاكتشاف كما في RIEcoأو RIIEco). هذا ويتم مراعاة كتابة الحروف الثلاث الأولى من اسم الإنزيم بشكل مائل (  style Italic ) .

يقطع كل انزيم تقييد الـ DNA بتسلسل قاعدي محدد يدعى بتسلسل التمييز (recognition sequence) كما في جدول 1 والذي يتنوع من 4 الى 16 أو 20 زوج قاعدي. وكلما طال عدد الازواج القاعدية في موقع التمييز كلما قل عدد القطوعات المعمولة في الـ DNA عادة. وإذا ما افترضنا توزيع الـ DNA بشكل عشوائي في جزيئة الـ DNA، عندها يمكن لنا أن نحسب كم مرة يمكن للإنزيم أن يقطع جزيئة الـ DNA.

جدول (1) نظام تسمية إنزيمات التقييد restriction enzymes كما هو موضح في عدة أمثلة (يشير الرمز / الى الموقع الذي يقطع فيه الانزيم القاطع، والرمز N الى أي قاعدة، والرمز R الى أي purine والرمز Y الى أي pyrimidine).

لابد من معرفة ملاحظة مهمة وهي أن لكل موقع في جزيئة الـ DNA هناك أربع احتمالات ( A أو C أو G أو (T، ولهذا، فان إنزيم التقييد الذي يميز تسلسل ذو أربع أزواج قاعدية 4-bp فأنها سوف تقطع، كمعدل مرة واحدة لكل bp-256 أي 4⁴، بينما تميز إنزيمات أخرى 6 أزواج قاعدية bp-6 أي أنها تقطع مرة واحدة لكل 4096-bp أي 4⁶ (شكل 3) .

شكل (3): تنساب تكرار قطع أشرطة الـ DNA من قبل الإنزيمات القاطعة عكسياً مع عدد النيوكليوتيدات المميزة في موقع الشق. فإنزيم التقييد الذي يميزتسلسل ذو أربع نيوكليوتيدات يقطع الـ DNA بتكرار أكثر وينتج قطع أصغر مقارنة بالإنزيم القاطع الذي يميز تسلسل ذو ست نيوكليوتيدات.

بعد أن تعرفنا على ماهية الانزيمات القاطعة، لابد لنا أن نعرف على كيفية تعرف الانزيمات القاطعة على تسلسلات التمييز الموجودة في الـ DNA كي تقطعها. وجد العلماء أن تلك الانزيمات تتبنى أشكالاً ثلاثية الأبعاد محددة والتي تتقدم على طول تسلسلات الـ DNA غير المتخصصة في حلزون الـ DNA المزدوج "ماسحة" اياه الى أن تصل الى تسلسلاتها المميزة المتخصصة. وهي التي تمثل مواد التفاعل المتعرضة للهجوم من قبل إنزيمات القطع الداخلي، وهي تسلسلات DNA بالندرومية palindromic DNA sequences. إن مصطلح بالندروم palindrome يشير إلى مجموعة من الحروف والتي تكون نفس الكلمة عندما تقرأ سواء من الأمام أو من الخلف. فعلى سبيل المثال ;"MADAM, I'M ADAM" ، أو العبارة : MA IS A NUN, AS I AM"" . أما في الـ DNA، يدعى موقع البالندروم palindrome site بتسلسل من الأزواج القاعدية بـ DNA الحلزون المزدوج والذي يقرأ بنفس القراءة سواء من الأمام أو من الخلف (من 5' إلى 3'أو العكس). وعلى سبيل المثال، يعد تسلسل الأزواج القاعدية GAATTC بالـ "بالندروم" لأن كلا تسلسلي الشريطين يقرآن بنفس القراءة سواء عندما تتم القراءة من النهاية G أو من النهاية C (شكل 4.)

شكل :(4) مثال حول التسلسل البالندرومي palindromic sequence (وهو التسلسل الذي يقطعه انزيم RIEco ) (تصميم المؤلف).

إن من أكثر الأمثلة المعروفة على الإنزيمات القاطعة هو إنزيم RIEco، والمخلق من قبل بكتريا E. coli من سلالة RY13. يقوم هذا الإنزيم بمهاجمة التسلسل النيوكليوتيدي GAATTCCTTAAG ربما يمكن لك أن تلاحظ بأن هذا البالندروم متناظر حول مركزه. يقوم إنزيم RIEcoبصنع قطوع مفردة الشريط تدعى بالشقوق "nicks"، بين قاعدة الأدنين وقاعدة الكوانين من كلا الشريطين وهذا يفتح جزيئة الـ DNA الدائرية.

هنالك أنواع معروفة مختلفة من إنزيمات القطع الداخلي، والتي تقطع مناطق مختلفة من جزيئة الـ DNA. وعلى أساس كيفية قطع تسلسل الـ DNA المتخصص هنالك نوعين من انزيمات التقييد حيث تقطع المجموعة الأولى بشكل مستقيم عبر حلزون الـ DNA المزدوج، لينتج DNA ذو نهاية مستوية blunt end DNA يقطع النوع الآخر من انزيمات التقييد شريط الـ DNA من مركز الموقع البالندرومي ولكن بين نفس القاعدتين النتروجينيتين على الشريطين المتعاكسين وهذا يترك قاعدة أو أكثر متدلية من كل شريط وتدعى هكذا نهايات بالنهايات اللزجة sticky ends (شكل 5.). وسميت بهذا الاسم بسبب تكوينها لأواصر هيدروجينية مع مكملاتها المقطوعة بنفس الإنزيم. وتكون النهايات اللزجة مهمة بالخصوص في تشييد جزيئات الـ DNA الهجينة recombinant DNA molecules .

شكل (5): أنواع إنزيمات التقييد حسب نوع القطع (A) مثال حول الانزيمات القاطعة من نوع النهايات اللزجة (( sticky ends (B) مثال حول الانزيمات القاطعة من نوع النهايات المستوية (blunt ends) (تصميم المؤلف).

وبما أن النهايتين المفردتي الشريط المتولدتين في مواقع الشق هما متكاملتين، لذا يمكن لها أن تصلح مع بعضها البعض. وهكذا، فان قطع الـ DNA المتولدة بواسطة نفس إنزيم القطع الداخلي يمكن لها أن توصل مع بعضها بسهولة بتكوينها للأزواج القاعدية (شكل 6 )

بعد قطع جزيئات الـ DNA الغريبة بواسطة الانزيمات القاطعة المناسبة لابد من ربطها بالنواقل الجينية الملائمة عادة، ويتم ذلك بواسطة الإنزيمات اللاحمة ligation enzymes أو DNA ligases تتم عملية ربط الشريطين بواسطة إنزيم اللحم sealing enzyme الذي يعرف بـ DNA ligase، والمكتشف في عام 1967 من قبل Martin Feller، والذي يقوم بالعمل كعامل لصق gluing" agent" لربط الأحماض النووية المفصولة ببعضها. يقوم هذا الإنزيم اللاحم بربط قطع الـ DNA تساهمياً. ويعمل انزيم DNA ligase خلال تضاعف الـ DNA، حيث يقوم بربط قطع أوكازاكي ببعضها البعض لكي يشيد الشريط المتلكئ lagging strand (راجع الفصل الثالث).

يحتاج انزيم DNA ligase الى شرطين ليقوم بعمله الأول، يجب أن تكون الجزيئات مواد تفاعل صحيحة، أي يجب أن تمتلك مجاميع هيدروكسيلية من نوع 3' ومجاميع فوسفاتية من نوع 5' ثانياً، يجب أن توضع تلك المجاميع في الجزيئات المراد ربطها بمواضع صحيحة بالنسبة لبعضها البعض وببساطة، اذا وجد انزيم DNA ligase قطعتي DNA تلمسان بعضهما البعض من نهايتيهما، فانه يلحمهما معاً. وفي تجارب الهندسة الوراثية، تميل قطع الـ DNA ذات النهايات اللزجة أن تبقى مرتبطة ببعضها الآخر لفترة طويلة، ونتيجة لذلك، يقوم انزيم DNA ligase بربطها بشكل كفوء. وبما ان قطع الـ DNA ذات النهايات المستوية ليس لها أي طريقة كي ترتبط ببعضها الآخر، فإنها تكون مبتعدة عن بعضها البعض لمعظم الوقت. وبالتالي تعتبر عملية لحم النهايات المستوية عملية بطيئة جدا وتحتاج الى تركيز عال من انزيم DNA ligase ، فضلاً عن التركيز العالي لقطع الـ DNA المراد لحمها. ومن الجدير بالذكر، أن انزيمات DNA ligases البكتيرية لا يمكن لها أن تربط النهايات المستوية. لذا، يتم استخدام انزيم T4 DNA ligase الذي اشتق أصلا من العاثي البكتيري T4 في ربط قطع الـ DNA ذات النهايات المستوية (شكل 6 )

شكل (6) لحم نهايات قطع الـ DNA بواسطة انزيم DNA ligaseفي تفاعل يحتاج الى الطاقة (A) نجاح لحم الـ DNA ذو النهايات المستوية أو النهايات اللزجة بواسطة انزيم B) T4 DNA ligase) نجاح لحم نهايات الـ DNA بواسطة انزيم bacterial DNA ligase و فشل لحم الـ DNA ذو النهايات المستوية بواسطة نفس الانزيم (تصميم المؤلف).

ويمكن أن تستخدم طريقة ثانية لتخليق الجزيئات المهندسة وراثياً مع قطع الـ DNA والنواقل الفاقدة للنهايات اللزجة، بسبب قطعها بإنزيم قاطع ينتج نهايات مستوية. فبعد قطع الناقل (كالبلازميد مثلا) والـ DNA الواهب، يمكن اضافة متعدد الأدنين (polyA) مثلا للنهاية 3' لـ DNA البلازميد باستخدام انزيم الناقل الطرفي أو terminal transferase (شكل 7). وبشكل مماثل أيضاً، يتم اضافة متعدد الثايمين (polyT) الى النهاية 3' لقطع الـ DNA الواهبة. وهنا يمكن للنهايات أن تربط ببعضها البعض بواسطة انزيم DNA ligase لتكوين الجزيئة أو الناقل الهجين واذا كان الذيل المضاف من قبل انزيم terminal transferase طويلاً جداً، عندها يمكن أن يدخل مباشرة الى الخلايا، حيث يمكن للفجوات والشقوق أن تملئ وتلحم من قبل الانزيمات الخلوية و يدعى هذا الإجراء بالتذييل ذو البوليمر المتجانس homopolymer tailing على الرغم من أن هذه التقنية تعد أكثر صعوبة من لحم النهايات اللزجة ولكنها تمتلك فائدة في ربط أي زوج من النهايات. ولكن هنالك مضاراً لهذه الطريقة والتي تتمثل بعدم السيطرة على اتجاه انحشار الجزيئات المرتبطة مع بعضها باستخدام هذه الطريقة، كما لا يوجد هنالك طريقة سهلة لاسترداد الـ DNA المنحشر بعد اندماجه في الجزيئة الناقلة.

شكل (7): التذييل ذو البوليمر المتجانس homopolymer tailing. يمكن استخدام تقنية التذييل بمتعدد الأدنين والثايمين في تشييد نهايات لزجة في جزيئة الـ DNA المرغوبة وتوليد جزيئات DNA هجينة (تصميم المؤلف).

 يمكن أن يستخدم ما يعرف بالواصلات (linkers) أيضاً لتوليد جزيئات DNA ذات نهايات لزجة مكملة لبعضها البعض (شكل 8) .

تعد الواصلات جزيئات DNA صغيرة ذات نهايات مستوية تحتوي على تسلسل تمييز لإنزيم قاطع ينتج نهايات لزجة. يمتاز لحم الواصلات بقطع الـ DNA بكفاءة عالية، وذلك بسبب سهولة الحصول على تراكيز عالية من الواصلات وبعد ربط الواصلات بقطعة الـ DNA، يتم هضم المزيج بالإنزيم القاطع، والذي يقطع الواصلات ويولد النهايات اللزجة. وبهذه الطريقة، تتحول الجزيئة ذات النهاية المستوية الى جزيئة ذات نهايات لزجة والتي من السهولة ربطها بجزيئات DNA أخرى.

شكل (8): عملية ربط الجزيئات الرابطة والمحتوية على موقع RIEco بواسطة الانزيم اللاحم T4 DNA ligase بجزيئات الـ DNA الغريبة ذات النهايات المستوية وبالنتيجة، تتكون جزيئات DNA ذات نهايات لاصقة بواسطة الانزيم القاطع RIEco . يدمج هذا الـ DNA بالناقل المعامل بنفس الانزيم القاطع (تصميم المؤلف).

إن ما ذكر أعلاه لا ينبغي أن يفسر بأن عملية كلونة الجين هي مجرد تقنية سهلة. لكن في الحقيقية، يعد إنتاج وتشخيص خلية بكتيرية تمتلك نسخة مندمجة فعالة من الجين المرغوب مهمة توصف بالهائلة.