التكشف غير المباشر في المعلق الخلوي

يعتبر الحصول على المعلق الخلوي من الإجراءات الروتينية لبعض معامل الإكثار الدقيق وكل معامل إنتاج المواد الفعالة معملياً. وعند إعداد المعلق الخلوي يجب التأكد من الكثافة الأولية المستعملة أو على الأقل وجود حد أدنى من نواتج عمليات الأيض لهذه الخلايا والتي يمكن الحصول عليها باستعمال بيئة سبق أن استعملت في نمو خلايا أخرى فيما يعرف بـ conditioned media. وقد تبقى الخلايا حية لكن لا تنقسم وتطول فترة الطور اللاجي Lag إذا لم يتحقق شرط الحد الأدنى من الكثافة الخلوية أو استعمال بيئة تحتوى على بعض نواتج عمليات البناء الضرورية. وعند إعادة تقسيم الخلايا لا بد من المحافظة على الحد الأدنى للكثافة الخلوية. فإذا كان حجم اللقاح المتاح قليل ويراد استعماله للحصول على حجم كبير من المعلق الخلوي فيتم تنمية اللقاح في حجم قليل من البيئة يزيد تدريجيا حتى يصبح مناسب لتلقيح حجم كبير.

ويتم الحصول على كالس مناسب لتكوين المعلق الخلوي بعد تنميته لمدة 4-6 دورات على بيئة شبه صلبة وبشرط التأكد من ثبات معدل النمو والذي يشير إلى تأقلم الكالس مع بيئة الزراعة. يقطع الكالس إلى قطع صغير إذا كان صلب أو يفصل منه أجزاء صغيرة باستعمال الملاقط إذا كان هشا وتنقل الأجزاء إلى البيئة السائلة التي توضع على جهاز هزاز دائري والكالس الهش أفضل لتكوين المعلق الخلوي لأن الكالس الصلب يستغرق فترة أطول لتكوين المعلق الخلوي. ويجب أن يحتوي المعلق القياسي على الخلايا في صورة فرديه وليست في صورة مجموعات، لذا قد تستخدم أنواع من الدوارق المخروطية مزودة بزوائد داخلية للمساعدة على تفتيت هذه الكتل (aggregates). لكن من النادر الحصول على معلق خلوي محتوى على خلايا فردية فقط إذ أنه في الغالب يحتوي على مجموعات من الخلايا بأقطار تتراوح بين 100 - 1000 ميكروميتر.

وعند إعادة تقسيم وزراعة المزرعة تزال كتل الخلايا الكبيرة من المعلق بالترشيح بقطعة من القماش المعقم ذات أقطار 0.1-0.5 مم . وتعتبر هذه الخطوة ذات أهمية بالذات في المراحل الأولى من إعداد المعلق الخلوي تختلف الطرق المستعملة لإعادة تقسيم وزراعة المعلق الخلوي على حسب الغرض من المزرعة وكذلك بين المعامل المختلفة وهل تتم إعادة الزراعة للمحافظة على النمو فقط، أم للحصول على سلالة خلوية ثابتة. يمكن أيضا الحصول على المعلق الخلوي مباشرة من النسيج النباتي والذي يفضل أن يكون أجزاء من البادرة أو حتى البذرة بهرس النسيج يدويا أو باستخدام جهاز الخفق homogenizer ثم يرشح الناتج لحجز الكتل الكبيرة. بعدها يتم الطرد المركزي للراشح وينقل الراسب إلى البيئة. وتستعمل أيضاً الإنزيمات كالبكتينيز لهدم مكونات الجدر الخلوية فتنفصل الخلايا عن بعضها. لكن من الناحية العملية يفضل الحصول على مزارع المعلق الخلوي من الكالس. ويبين شكل رقم (1) مراحل نمو الخلايا في المعلق الخلوي.

شكل 1: مراحل نمو الخلايا في المعلق الخلوي (1991 Stafford & Warren.,).

يفضل أن يتم إعادة زراعة المعلق الخلوي في نهاية الطور التضاعفي Exponential من مراحل النمو، ويتم ذلك بنقل حجم مناسب من المعلق الخلوي إلى حجم محدد من البيئة الجديدة وبمعدل زمني ثابت وكما سبق القول الحجم المستعمل كلقاح لا بد أن يحتوى على عدد من الخلايا أعلى من الحد الأدنى الضروري للنمو، فعلى سبيل المثال يستعمل لقاح بنسبة 1:5 من المعلق الخلوي لخلايا نباتات Catharanthus roseus. ومن الأفضل ترشيح المعلق واستخدام 5 جم وزن رطب من كتل الخلايا والخلايا لتلقيح 100 مل من البيئة في حالة احتواء المعلق الخلوي على كتل من الخلايا ذات أقطار أكبر من 1 مم. ويتحقق الحصول على خلايا ذات تباين قليل بإجراء إعادة الزراعة على فترات قصيرة مثلاً كل يوم (1998 ,Collin & Edward).

وكما هو في زراعة الكالس يجب تدوين كافة البيانات على كل دورق من حيث نوع المزرعة، والتاريخ، ومعدل النمو، والحجم المستخدم للزراعة، الخ. ويلاحظ أن الخلايا النباتية أثناء المراحل الأخيرة من دورة الخلية - وعلى العكس من الخلايا البكتيرية - تكون كبيرة الحجم وذات جدار خلوي صلب وفجوات عصارية كبيرة الحجم. هذه المواصفات تجعل الخلايا حساسة للإجهاد التقسيمي Shear stress. وعلى هذا يجب تحريك المعلق الخلوي برفق حتى لا يحدث ضرر للخلايا ويتم ذلك باستعمال هزاز ذو قوة منخفضة 50-200 لفه / دقيقة. لكن تكون هذه السرعة المنخفضة سبباً في عدم الخلط الجيد للمزرعة مما يؤثر في عمليات الأيض. ومن ثم فإن معدل النمو وحجم اللقاح والحساسية للحركة لا بد وأن تؤخذ في الاعتبار عند استعمال المعلق الخلوي في الأغراض المختلفة.

ويمكن تقليل التباين الحادث في الكالس بدرجة كبيرة باستخدام نظام المعلق الخلوي حيث تكون كل الخلايا منغمسة داخل وسط النمو للتغلب على التدريج الحادث في مكونات البيئة ونواتج عمليات البناء بين الخلايا والبيئة. لكن لسوء الحظ لا يمكن الحصول على درجة تماثل تام حتى في المعلق الخلوي حيث أن الخلايا النباتية تميل إلى النمو في صورة مجموعات وليست خلايا فردية. ورغم أن هناك بعض الطرق تتبع للحصول على معلق خلوي ذو كتل خلايا دقيقة الحجم أي مكون من خلايا فردية فإن المعلق لا يستمر على ذلك لمدة طويلة، وتحتوي اغلب المعلقات الخلوية على كتل صغيرة من الخلايا. يؤدى احتواء المعلق على كتل كبيرة الحجم من الخلايا إلى عدم التماثل كما هو الحال في زراعة الكالس. ومازال هناك جدل حول نوعية المعلق الذي يفضل استعماله فمن الناحية النظرية المعلق الدقيق يفضل في حالة إنتاج المركبات الثانوية، لكن من الناحية التطبيقية بعض نواتج عمليات البناء يتم تخليقها في المعلق الدقيق لكن يرتبط معدل تخليقها بحدوث درجات معينة من التكشف والتي لا تتم إلا في حالة وجود كتل من الخلايا (1991 Stafford & Warren).

نمو معلق الخلايا

في الظروف العادية تزداد الخلايا النباتية في الحجم ثم ما تلبث أن تنقسم مكونة خليتين لهما القدرة على النمو والانقسام. وإن لم تكن الظروف البيئة مهيأة للنمو والانقسام كارتفاع أو انخفاض الرقم الهيدروجيني للبيئة أو وجود مواد سامة أو تراكم بعض نواتج عمليات الأيض المثبط للنمو فإن الخلية يمكنها المحافظة على حيويتها دون انقسام. ويقاس النمو على مستوى الخلايا الفردية بحدوث دورة النمو الكاملة للخلية أما على مستوى العشيرة الخلوية فإن النمو يمكن أن ينظر إليه في صورة دورة النمو في بعض الأنواع النباتية وتكون الاختلافات الوراثية بين النباتات الناتجة من الكالس أو المعلق الخلوي كبيرة، رغم اعتبار ذلك مشكلة من ناحية الإكثار الخضري. وفى البداية اعتقد أن المعلق. الخلوي قد يكون هو الوسيلة الناجحة لإكثار العديد من النباتات خاصة الأشجار التي تكون في الغالب متضاعفة.

إلا أنه بسبب التباين الوراثي العالي لا تعد هذه هي الوسيلة المستهدفة لإكثار الكثير من النباتات، لكن لهذا التباين أهمية كبيرة من وجهة نظر مربى النبات كمصدر للتباين الوراثي، ويمكن بالرجوع إلى (1990 Dix,) معرفة التطبيق العملي لمزارع المعلق الخلوي في إنتاج العديد من الأصناف المقاومة لكثير من الإجهادات البيئية أو الحيوية. ولحسن الحظ يبدو أن النبيتات المستولدة من كالس له قدرة تكشفيه عالية تكون ثابتة وراثياً بدرجة أكبر من تلك الناتجة من كالس له قدرة تكشفيه أقل. ويجب الحرص على عدم استعمال أنسجة بها تضاعف داخلي endoreduplication للإكثار. كما يجب تجنب إضافة تركيزات عالية من منظمات النمو المشجعة على التباين الوراثي مثل 2,4-D. وهناك عديد من الطرق التي تستعمل لقياس النمو في المعلق الخلوي ويتوقف استعمال أي منها على طبيعة المعلق والخلايا وهل يحتوي على خلايا فردية غالبا أم على كتل خلوية وكذلك الغرض من زراعة المعلق وهذه الطرق هي:

1. الوزن الطازج والجاف: ويعتمد على تقدير كتلة النمو الحيوي بوزن الخلايا الطازجة بحيث توضع ورقة ترشيح مشبعة بالبيئة المستخدمة في الزراعة ومعلومة الوزن فوق قطعة من القماش على قمع Bucher. ثم يقدر وزن الخلايا بعد الترشيح تحت تفريغ وبغسيل الخلايا فوق ورقة الترشيح وتجفيفها على 60 م يمكن حساب الوزن الجاف للخلايا في حجم معلوم من البيئة. مع الأخذ في الاعتبار أن النمو يتوقف على حجم البيئة المستعملة في نمو المعلق. وبتكرار أخذ عينات من المعلق على فترات ثابتة وهي ثلاثة أيام غالباً وتوقيع النتائج بيانيا يمكن الحصول على منحنى النمو للمعلق. لكن قد تكون النتائج مضللة فتراكم نواتج الأيض كالنشا داخل الخلايا يزيد وزنها لكن لا يمكن اعتبار ذلك زيادة في النمو بصورة مطلقة. لذا ينصح بإجراء قياس آخر كعد للخلايا بجانب قياس الوزن الطازج والجاف

2. عدد الخلايا: يبدأ نمو الخلايا النباتية في المعلق الخلوي بالطور اللاجي ثم الأسى ثم الثبات وينتهي بطور الموت. وتكون الزيادة في عدد الخلايا قليلة لكن بمعدل نشاط أيضي واضح في الطور اللاجى والذي تتوقف مدته على حجم اللقاح الموجود بالبيئة. ثم تدخل الخلايا في الطور الأسى ويزيد عددها مع زيادة في وزنها الطازج والجاف. ويعبر طور الموت عن الخلل في مكونات البيئة أثناء نمو المزرعة وباستنفاذ مكوناتها أو بزيادة تراكم نواتج الأيض السامة. وتحت ظروف النمو المثلى يزيد عدد الخلايا في المعلق بطريق لوغارتمية ثابتة، فبفرض أن عدد الخلايا الأساسي في المعلق هو "ن" فإن عدد الخلايا في المعلق الخلوي يزيد ليكون "2ن" ثم "4ن" ثم "8ن" وهكذا. ويقدر عدد الخلايا باستخدام المجهر وشريحة العد المستخدمة لعد كرات الدم haemocytometer عقب تكسير الكتل الخلوية في المعلق الخلوي إلى خلايا فردية باستعمال محلول chrominum trioxide أو إنزيم البكتينيز على أن يستخدم محلول منظم للضغط الأسموزي للمحافظة على حجم الخلايا. ويمكن تخزين العينة لمدة تصل إلى أسابيع أو يتم القياس فورا على أساس نوع المعلق بعد التخفيف بالماء لتصل إلى 200 خلية تقريباً لكل 10 ميكروليتر.

3. حيوية الخلايا: وذلك بقياس قدرة الغشاء البلازمي على تجميع أو منع دخول بعض الصبغات حيث يقاس التحليل الإنزيمي المائي في الغشاء البلازمي للمركبات ذات الوميض الضوئي مثل fluorescien diacetate والذي ينتج عنه تراكم مركبات fluorescein ذات الوميض الأخضر المميز للخلايا الحية عند تعريضها لأشعة طولها الموجي 360 أنجستروم. كذلك فإن استعمال الصبغ بصبغة Evans blue يؤدى إلى صبغ الخلية غير الحية فقط. وبذلك يمكن تقدير النسبة المئوية للحيوية بنسب عدد الخلايا الحية إلى العدد الكلى للخلايا كما يمكن قياس الحيوية بالفحص المجهري الدقيق على أساس القياس الميكروسكوبي للغشاء الخلوي، النواة، تدفق السيتوبلازم. ويمكن استخدام هذا المقياس كدليل للنمو لكن حيوية الخلايا لا تعنى بالضرورة قدرتها على النمو والتكشف.

4. الحجم المعبأ للخلايا Packed cell volume: وهو يعبر عن الحجم الفعلي للخلايا لكن يجب ألا يحتوي المعلق الخلوي على كتل من الخلايا. يؤخذ حجم معلوم من المعلق الخلوي ويوضع في أنبوب طرد مركزي مستدق الشكل ومدرج. ويتم الطرد المركزي حتى تمام الترس سيب ويقدر حجم الراسب ثم يعبر عن حجم الخلايا المعبأ منسوباً إلى الحجم الكلى للعينة. ويمكن استخدام نفس العينة لتقدير الوزن الرطب والجاف وعدد الخلايا.

5. المكونات الحيوية للخلايا Cell biocompounds : باستخدام محتوى الخلية من البروتين أو الأحماض النووية أو النتروجين بالطرق المعروفة. وتمثل هذه المواد نسبة ثابتة من الوزن الجاف.

6. معامل الانقسام الميتوزي MI) Mitotic index): يتم الانقسام الميتوزي في عدة مراحل هي Prophase و Metaphase و Anaphase و Telophase (التمهيدي، والاستوائي، والانفصالي والنهائي). وفى النهاية تتكون خليتان جديدتان. وبذلك ينتج عنه نمو مباشر في الكائن بزيادة عدد الخلايا مع المحافظة على عدد الكروموسومات بها وهو أحد مؤشرات النمو الفعلي ويمكن بسهولة تمييز الخلايا التي دخلت مرحلة الانقسام الميتوزى عن تلك التي في مرحلة Interphase بالميكروسكوب الضوئي حيث تكون الكروموسومات مندمجة قصيرة الطول ويسهل رؤيتها وعدها بعد صبغها بصبغات تصبغ الحامض النووي. يلاحظ أن زمن الانقسام الميتوزي يكون قصيرا نسبيا مع الدورة الكاملة للخلية ويعبر معامل الانقسام الميتوزى MI عن عدد الخلايا التي توجد في مرحلة الانقسام منسوباً إلى العدد الكلى من الخلايا وهو مقياس بسيط وذو دلالة هامة في قياس النمو لكنه يتطلب وقتا.

7. تقدير مكونات البيئة والتوصيل الكهربي: يعتبر استنفاذ المكونات المختلفة للبيئة من الطرق التي يمكن استخدامها لقياس النمو. لكن يجب الحذر فاستهلاك بعض المواد كالفوسفات قد يفسر بطريقة خاطئة. كما يمكن قياس الذائبات الخلوية التي ترشح من الخلية إلى البيئة والذي يعكس حيوية الغشاء الخلوي ويتم ذلك بقياس التوصيل الكهربي للبيئة وهناك علاقة عكسية بين شدة التوصيل الكهربي والنمو. ويشيع استخدام هذا المقياس في حالة استعمال المفاعلات الحيوية Bioreactor لإنتاج المواد الفعالة.