تعقيم معمل زراعة الأنسجة
Sterilization
يجب المحافظة على نظافة وتعقيم معمل زراعة الأنسجة وخاصة حجرة الحقن ومعمل النمو. لأن التلوث يعنى فساد المزروعات وضياع الوقت والمجهود وفقدًا للكيماويات.
مصادر تلوث معمل زراعة الأنسجة
1- تلوث المواد الكيميائية الداخلة في تركيب البيئة والأدوات المستخدمة في تداولها، لذلك يجب تخصيص أدوات محددة لكل مادة كيميائية لمنع انتقال التلوث من مادة كيميائية إلى أخرى.
2- عدم نظافة وتعقيم الأدوات المستعملة وعدم نظافة وتعقيم الأرضيات وعدم إزالة المخلفات بسرعة من المعمل وعدم اهتمام العاملين بالنظافة الشخصية.
3- النوافذ والأبواب غير محكمة الغلق التي تسمح بدخول الأتربة إلى المعمل هي من المصادر الهامة للتلوث.
ويجب أن يتوفر في المعمل دقة التصميم الهندسي لمنع نفاذ الأتربة إلى داخله.
1- تعقيم حجرة الحقن
Sterilization of inoculation room
1 - تنظف منضدة الكابينة بالكحول 96 %، ولا يستخدم كحول 70 % حتى لا تترك قطرات من الماء بعد تطاير الكحول وتصبح مصدرا للتلوث. ثم تجفف الكابينة بقطعة من القماش الجيد الذي لا يترك أية بقايا.
2- يفضل تشغيل الكابينة لمدة 15 دقيقة قبل بدء العمل للتأكد من سلامتها.
3- تترك أحيانا لمبات الأشعة فوق البنفسجية (UV) مضاءة طوال الليل لتعقيم حجرة الحقن ومحتوياتها قبل استخدامها في اليوم التالي، وقد يفضل إضاءتها قبل بدء العمل بفترة لا تقل ولا تزيد عن 30 دقيقة مع التأكد من غلق الأبواب بإحكام. ويجب عدم النظر إليها أثناء تشغيلها لحماية العين من الأضرار.
كابينة تيار الهواء المعقم Laminar flow hood
يتم في هذه الكابينة فصل الأجزاء النباتية وزراعتها في أوعية الزراعة المعملية. ويجب أن يتوفر فيها التعقيم التام أثناء إجراء الزراعة. وتتميز هذه الكابينة بقدرتها على تنقية وتعقيم الهواء المار بداخلها. حيث يمر الهواء الجوي بضغط ثابت خلال مرشحات أقل من ميكرون لمنع مرور ذرات التراب وما تحمله من كائنات دقيقة، ثم يمر الهواء داخل الكابينة بعد أن يصبح على درجة عالية من النقاوة والتعقيم. ويجب تغيير الفلتر بآخر جديد سنويا. ويثبت في سقف الكابينة لمبات فلوروسنت كمصدر للإضاءة. ويتوفر في الكابينة مصدر غاز يستخدم كلهب لتعقيم الأدوات المستخدمة في الزراعة والحقن أو يستخدم بدلا منه مصباح كحولي.
2- نظافة وتعقيم الأدوات المعملية
1- نظافة الأدوات الزجاجية
تنظف الأوعية الزجاجية والأدوات المعملية في حجرة الغسيل وتنظف الزجاجيات الجديد منها الذي لم يسبق استعماله في إناء يحتوي على خليط من حمض الكروميك وحمض الكبريتيك أو منظف صناعي. ثم تغسل تحت تيار ماء جار لفترة لا تقل عن 5 دقائق يعقبها غسيل بماء مقطر معقم مرتين متتاليتين، ثم تحفظ جميعها بعيدا عن الأتربة. ويعاد غسلها مرتين بالماء المقطر قبل استخدامها إذا خزنت لفترة طويلة. فإذا تلوثت الأرضية بمخلوط الحامضين المذكورين أو كليهما فتنظف باستخدام مصدر مائي ذي ضغط عال. لذلك يجب أن تكون أرضية المعمل مقاومة للأحماض ويجب استعمال قفازات وبلاط مقاومة للأحماض وتنظف الزجاجيات المستعملة بسرعة قبل جفاف الآجار والتصاقه بجدار الوعاء ويبدأ تنظيف الأنابيب بإزالة السدادات ثم توضع في ماء ساخن ويستخدم ملقاط وفرشاة مناسبة للتخلص من الآجار وبقايا النباتات الموجودة في الأنابيب. ويفضل استخدام غسالة أطباق لغسل الأواني الزجاجية، ثم تشطف بماء مقطر خال من الأيونات، ثم تجفف جيدا في فرن تجفيف بعد التأكد من نظافتها، ثم تخزن بسرعة بقدر الإمكان لتقليل فرصة تلوثها.
2 - تعقيم الأدوات المعملية
الأدوات المعملية تشمل جميع الأواني الزجاجية والبلاستيكية المستخدمة في الزراعة والأدوات الأخرى مثل السكاكين والمشارط والملاقط والمقصات وغيرها. ويتم التعقيم بأشعة جاما أو بالضغط البخاري باستخدام الأوتوكلاف أو بالحرارة الجافة. ولا تستخدم الأوعية البلاستيكية منخفضة الجودة إلا مرة واحدة لأنها لا تتحمل حرارة التعقيم المرتفعة ولها عمر افتراضي تصبح بعده غير صالحة للاستعمال. ويستخدم الإشعاع بنجاح في تعقيم الأدوات المعدنية والأواني الزجاجية والبلاستيكية بصرف النظر عن جودتها. ويفضل استخدام الأوتوكلاف أو أفران الحرارة الجافة في تعقيم الأواني الزجاجية والأواني البلاستيكية التي تتحمل حرارة التعقيم عادة مرتفعة الثمن وتعقم مثل الزجاجيات ولها بعض المشاكل مثل انبعاث الإيثلين منها، وهو مركب ضار للبيئة وسام للنباتات. وتعقم الأدوات الزجاجية بالحرارة الجافة في فرن حرارته 150 م لمدة ساعة واحدة، على أن تكون من الزجاج المقاوم للحرارة مثل Pyrex أو بوروسليكات Borosilicate وهي مرتفعة الثمن، والأنواع الرخيصة منها لا تتحمل الحرارة المرتفعة، وينفرد منها كاتيونات سامة مثل الصوديوم والرصاص والزئبق إلى البيئة الغذائية. ويستخدم الزجاج البيركس بصفة خاصة لزراعة البروتوبلاست والخلايا الفردية والأنسجة المرستيمية. ويجب الأخذ في الاعتبار ما يلي:
1- تغلف الأدوات المعملية مثل السكاكين والمشارط والملاقط والمقصات وغيرها بورق ألومنيوم قبل تعقيمها في الأوتوكلاف، وتظل مغلفة بعد تعقيمها للحفاظ عليها معقمة حتى وقت استعمالها وتوضع الماصات والحقن داخل علب خاصة بها ثم تغلف كل علبة بورق الومنيوم للمحافظة عليها بعد التعقيم.
2- عند الزراعة المعملية يغمس طرف الآلة المستخدمة في كحول، ثم تعرض إلى لهب من مصباح بنز ثم يوضع في ماء معقم ليبرد ويجب عدم وضع أية أداة في كحول بعد تعرضها مباشرة لمصدر حرارى حتى لا يحدث انفجار أو التهاب للكحول و قد يؤذى القائم بالزراعة المعملية.
3- يجب عدم ملامسة الأدوات المعملية سطح البيئة الغذائية عند نقل وزراعة الجزء أو النسيج النباتي.
4 - يفضل استخدام ماصات Pipettes أو سرنجات Syringes معقمة لضمان عدم تلوث البيئة الغذائية وتخصص واحدة منها جديدة ومعقمة لكل نوع من المحاليل المستخدمة.
5- يجب تغطية الشعر تماما ووضع كمامة فوق الأنف والفم. وتطهير الأيدي وأي جزء آخر مكشوف من الذراع بالكحول حتى لا يكون مصدرا لتلوث البيئات الغذائية والأجزاء النباتية.
3- تعقيم البيئة الغذائية
Sterilization of nutritional medium
يجب التأكد من نقاوة وتعقيم المركبات الداخلة في تكوين البيئة ومنع تلوثها. ويفضل تحضيرها قبل الاستعمال مباشرة، ويجب ألا تزيد فترة تخزينها عن 14 يوما.
1- التعقيم بالأوتوكلاف
تعقم معظم البيئات الغذائية في الأوتوكلاف ، وهو جهاز تعقيم بخاري تحت ضغط يتميز بسرعة وسهولة التشغيل. ويختلف الأوتوكلاف في شكله وحجمه فمنه الأفقي الذي يتم تحميله من الأمام والرأسي الذي يتم تحميله من أعلى. والنوع الأفقي أسهل استعمالا وأعلى سعرا. وتصل حرارة التعقيم 115 - 135 م. لذلك فالأوتوكلاف قادر على تحطيم جميع الكائنات الدقيقة والفيروسات. وتعتمد كفاءة التعقيم على مدة التشغيل والضغط البخاري المستعمل ودرجة الحرارة وحجم المواد المطلوب تعقيمها. ويحتاج تعقيم الأحجام الكبيرة من البيئة الغذائية الموجودة في عبوة واحدة إلى فترة زمنية أطول لضمان تجانس توزيع حرارة التعقيم (جدول 1) كذلك تحتاج إلى فترة أطول بعد تعقيمها لكي تفقد حرارتها المرتفعة. وقد يؤدى إطالة فترة التعقيم أو فترة ما بعد التعقيم إلى تلف البيئة أو احتراق بعض مكوناتها مثل السكر. لذلك يفضل توزيع البيئة على أنابيب أو دوارق بمعدل 20-100 مللي لكل منها لضمان اكتمال وتجانس التعقيم وحماية مكوناتها من التغيير ويتم التعقيم بعد 15 - 20 دقيقة عند 121 م وضغط بخاري واحد كيلوجرام/ سم3. وتغلق أنابيب الاختبار أو الدوارة الزجاجية المحتوية على بيئة غذائية قبل وضعها في الأوتوكلاف بسدادة من القطن محاطة بطبقة من الشاش للمحافظة على تعقيمها بعد التعقيم. وقد تستخدم أغطية مخصصة للأنابيب والدوارة الزجاجية على أن تكون غير محكمة الغلق لتساعد على تمدد الهواء داخلها ومنع انفجارها داخل الأوتوكلاف. وقد تستخدم أغطية تحتوي على نتوءات داخلية تلامس السطح الخارجي للأنبوبة الزجاجية وتسمح بتبادل الغازات ويستخدم أيضا قطع مربعة مناسبة من ورق الألومنيوم سمك 0,25 ملليمتر، حيث توضع قطعة ورق الألومنيوم فوق فوهة الأنبوبة أو الدورق ثم تطوى أطرافها برفق حول محيط العنق، ويؤدى إحكام غلق الأوعية إلى عزل محتواها عن المحيط الخارجي وخلق ظروف لا هوائية داخلها. ويتميز غطاء الألومنيوم بإمكان رفعه وإعادة تعقيمه واستعماله لإضافة مادة كيميائية أو جزء نباتي. ويمكن استخدام غشاء من البوليثين polythcnc بعد تعقيمه في 70% كحول إيثايل بدلا من ورق الألمونيوم.
ويتوفر في الأسواق أجهزة لتحضير وتعقيم كميات ما بين 0٫5 - 16 لترا. ويتم تعقيمها تحت ضغط بخاري. ويتم خلط البيئة مع التقليب أثناء التعقيم لضمان الخلط الجيد وإذابة جميع مكوناتها وسرعة التسخين وتجانس الحرارة في البيئة. وبعد التعقيم تبرد البيئة بسرعة تحت تيار ماء جار ثم تضاف المكونات التي تتحمل الحرارة أولا مع التقليب. بعدها تصبح البيئة معقمة صالحة للتوزيع في أواني الزراعة.
جدول (1) مدة التعقيم بالأتوكلاف عند درجة حرارة 121 م
سلبيات التعقيم بالأوتوكلاف
( أ ) حدوث تحلل مائي للسكروز إلى فركتوز وجلوكوز وسكريات وأحماض سكرية. وارتفاع حرارة التعقيم أكثر من اللازم قد يؤدى إلى كرملة السكر.
(ب) حدوث تغيير في رقم حموضة البيئة الغذائية (pH) بمقدار 0.3-0.5 وحدة، مما يسبب انفصالا لبعض مكوناتها وحدوث بعض التفاعلات الجانبية بينها وانخفاض فاعليتها.
(ج) حدوث تحطيم لبعض المركبات الداخلة في تكوين البيئة مثل الكولشيسين والزياتين Zeatin والجبريلين وفيتامين (Thiazol (B1 وPyrimidine وفيتامين B (Partothenic) و Vitamin C والمضادات الحيوية والإيثريل Ethrel والإيثلين Ethylene .
2 - التعقيم بالمرشحات Sterilization by filtration
يستخدم للتعقيم مرشحات خاصة مثل Millipore MF filters ذات مسامية 0.22 ميكروميتر للتخلص من جميع الجسيمات العالقة والكائنات الدقيقة، حيث تمرر المحاليل والبيئات السائلة وغيرها خلال أغشية الفلتر .
وتستخدم هذه الطريقة بدلا من التعقيم بالضغط البخاري (الأوتوكلاف). والتعقيم بالترشيح يؤدى إلى احتفاظ البيئة بمكوناتها الغذائية بدون تغيير ويؤخذ عليه ادمصاص بعض المركبات على سطح الفلتر، ولذلك يفضل استبعاد الكمية الأولى من الراشح لاحتمال عدم مطابقته للمواصفات المطلوبة، كما أن بعض الفيروسات قد تكون صغيرة ولها القدرة على المرور خلال الفلتر .
4 تعقيم الأجزاء النباتية Sterilization of explants
الأجزاء النباتية المفصولة من نباتات نامية في الحقل عادة تكون ملوثة بأنواع مختلفة من الكائنات الدقيقة. ويعتبر الهواء والأتربة ومياه الري والآفات وغيرها أهم مصادر للتلوث وزراعة الأجزاء النباتية الملوثة يؤثر تأثيرا سيئا على نمو وتطور النموات. لذلك فتعقيم الأجزاء النباتية القادمة من الحقل شرط أساسي.
خطوات التعقيم
1- يغسل الجزء النباتي تحت تيار مستمر من ماء الصنبور لمدة 1 - 2 ساعة لتنظيف سطحه الخارجي جيدا والتخلص من الأتربة العالقة عليه وتخفيض الحمل الميكروبي.
2- يغمس الجزء النباتي في محلول التعقيم للقضاء على ما تبقى من الأحياء العالقة على سطحه. واختيار المادة الكيميائية المعقمة والفترة الزمنية المناسبة للتعقيم يعتمد على حساسية الجزء النباتي المراد تعقيمه. ويؤدى التعقيم الشديد إلى التخلص من الكائنات الدقيقة المنتشرة على السطح الخارجي. وقد يؤدى أيضا إلى تدمير بعض الأنسجة الخارجية للجزء النباتي. لذلك يجب اختيار مادة التعقيم والفترة المناسبة للتعقيم بدقة.
3- يغسل الجزء النباتي بالماء المقطر المعقم عدة مرات للتخلص من الآثار المتبقية من مادة التعقيم مع الاهتمام بإزالة جميع الأنسجة المتضررة والتالفة من تأثير مادة التعقيم.
4- يقطع الجزء النباتي إلى أحجام مناسبة للزراعة المعملية تحت ظروف معقمة، ويستخدم في ذلك أدوات معقمة جيدا ثم تزرع الأجزاء النباتية تحت ظروف تعقيم في أواني الزراعة مثل أنابيب الاختبار ودوارة مخروطية وأطباق بترى تحتوي على بيئة غذائية. ويراعى أن تكون الأواني والبيئة الغذائية معقمة جيدا.
تعقيم الأجزاء النباتية بالكيماويات Chemical sterilization
تعقم الأجزاء النباتية سطحيا باستخدام مركبات مثل هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) وهيبوكلوريت الكالسيوم وماء البرومين وفوق أكسيد الإيدروجين ونترات الفضة وكلوريد الزئبق وكحول الإيثايل وأكسيد الإيثلين ويفضل إضافة 0,05٪ من مادة ناشرة مثل 20-Teepol; Trigetol; Tween إلى محلول التعقيم لتسهيل انتشاره على الأسطح الخارجية للأجزاء النباتية وزيادة كفاءته في قتل الكائنات الدقيقة. ويستخدم هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 1% بنجاح في التعقيم لانخفاض أضراره الجانبية. حيث يتحلل هيبوكلوريت الصوديوم إلى كلورين ذات الأثر الفعال في التعقيم، ويتفاعل الصوديوم مع الماء ليكون هيدروكسيد الصوديوم، وهو مركب سهل التخلص منه بالماء. ويحتاج التعقيم من 5 إلى 30 دقيقة في محلول ٪1 هيبوكلوريت الصوديوم. وإطالة فترة التعقيم قد يكون لها تأثير ضار على الجزء النباتي. وقد يستلزم تغطية الأسطح المجروحة على الجزء النباتي بالبرافين لمنع نفاذ محلول التعقيم إلى الأنسجة الداخلية ومنع خروج السائل الخلوي. ويستخدم البرومين بتركيز 1% لتعقيم البذور قبل زراعتها مباشرة. ويسبب البرومين بعض الأضرار للجنين إذا كان غلاف البذرة رقيقا. ويستخدم فوق أكسيد الإيدروجين (H2O2) في التعقيم، وهو سهل التحلل إلى أكسيجين وماء وهى شقوق غير ضارة وتتبخر بسهولة ويسبب هذا المركب بعض الأضرار حيث يفقد النسيج النباتي بعضا من رطوبته أو يؤدى إلى جفافه، ومحلول كلوريد الزئبق المخفف يعقم الأنسجة النباتية بنجاح، خصوصا الأجزاء النباتية المغطاة بطبقة كيوتين أو ذات أسطح غير مستوية. ويؤخذ عليه صعوبة إزالة آثاره المتبقية على الجزء النباتي بالماء. ويمكن إزالته بكحول إيثايل أو مسحوق غسيل أو خليط بينهما. لذلك يجب تحديد فترة التعقيم وتركيز مادة التعقيم المستخدمة لكل نوع نباتي (جدولا 2 ، 3).
جدول (2) الفترة الزمنية (الدقيقة) والتركيز المناسب من مادة هيبوكلوريت الصوديوم
جدول (3) بعض المواد المستخدمة في تعقيم الأجزاء النباتية
مواصفات مواد التعقيم
يجب أن تتوفر في مواد التعقيم سهولة التخلص من آثارها بالشطف في الماء. وأن تكون غير قابلة للتفاعل مع مكونات النسيج النباتي حتى لا تتكون مركبات لها تأثير ضار على النموات الجديدة. ويجب أن تتحلل بسهولة إلى مكونات أقل سمية من المادة الأصلية وسهولة التخلص منها بالماء وأثناء تعقيم الأجزاء النباتية قد يظهر عليها لون بني نتيجة تكوين صبغة الميلانين. ويمكن منع هذه العملية بغمس الأجزاء النباتية في محلول حمض أسكوربيك تركيز 100 ملليجرام / لتر، ثم غمسها في حمض الستريك تركيز 150 ملليجرام / لتر.
التلوث الذاتي للأجزاء النباتية
يظهر أحيانا نموات للكائنات الدقيقة في بعض الأواني المحتوية على مزروعات. وقد يرجع ذلك إلى رداءة التعقيم. وقد يكون مصدر التلوث هي الأنسجة الداخلية للجزء النباتي نفسه التي يصعب على مواد التعقيم الوصول إليها. وتظهر النموات الميكروبية إذا تلامست الأسطح المجروحة على الجزء النباتي للبيئة الغذائية. وتظهر النموات المصابة ضعيفة وشاحبة وتموت ، ويجب التخلص من هذه الأواني فورا. وتساعد البيئة الغذائية الغنية على زيادة انتشار الإصابة الميكروبية. وقد تحدث طفرات ميكروبية قادرة على النمو على البيئة الفقيرة. وقد تكون القمة النامية للساق مصدرا للتلوث لصعوبة تخلل مواد التعقيم بين الأوراق المتجمعة والملاصقة لها. لذلك تعقم القمة النامية على مراحل متتالية تبدأ بغسلها جيدا بالماء ثم تعقم ظاهريا ، ثم تزال بعض الأوراق وتعقم مرة ثانية. ويكرر التعقيم بعد كل إزالة لبعض الأوراق. ويفضل أحيانا إجراء اختبار لتقدير كفاءة التعقيم. حيث تحضر بيئة يضاف إليها 2-3 % تريبتون Tryptone أو بيبتون Peptone. ثم تزرع عليها أجزاء من الطرف القمي الأحد الأفرع بعد قطعها طوليا ويكون السطح المجروح ملامسا للبيئة. وبعد أيام قليلة تظهر بوضوح نموات للكائنات الدقيقة إن وجدت. ونتائج هذه الطريقة غير مشجعة دائما حيث لا توجد بيئة غذائية قياسية يمكن استخدامها كدليل جيد لكل أنواع البكتيريا التي تنمو داخل الأنسجة النباتية. ويساعد على ظهور التلوث الذاتي ما يلي :
1- عدم غسل وتعقيم الأيدي. وعدم استخدام أقنعة للفم والأنف وأغطية للشعر وقفازات معقمة وعدم استخدام بلاط معقمة وعدم السماح بدخول أعداد كبيرة من الزائرين داخل حجرة الحقن. والتعقيم الردى، لكابينة الحقن. وعدم تغطية الأحذية بغطاء بلاستيك أو غمس نعل الحذاء في محلول معقم عند دخول حجرة الحقن. لذلك يجب التأكد من سلامة وتعقيم حجرة الزراعة وكابينة الحقن بدفع هواء معقم داخل الكابينة والتشعيع بأشعة (UV) أثناء الليل وتجديد الفلاتر الأمامية للكابينة سنويا.
2- عدم تعقيم منضدة العمل بكحول إيثانول 96% وعدم تعقيم الأرضيات. والتعقيم الردى للأدوات المستخدمة.
3- قد تكون الأسطح الخارجية للأنابيب والدوارق المخروطية غير معقمة جيدا، لذلك يفضل تعقيمها ثم تخزينها في ظروف معقمة حتى ولو كانت محتوية على بيئة غذائية.
5- وجود بعض الكائنات الحية مثل العناكب، حيث إن لها القدرة على النفاذ بسهولة خلال الأغطية القطنية وشرائط البلاستيك حاملة معها الكائنات الدقيقة إلى البيئة الغذائية في الأنابيب والدوارق.
طرق التغلب على التلوث الذاتي
1- زراعة الطرف المرستيمى Meristemic tip
يفضل استخدام القمة المرستيمية المحاطة بواحدة أو اثنين من منشئات الأوراق لخلوها من الفيروس. وقد يرجع ذلك إلى عدم اكتمال تكوين الأوعية الناقلة في القمة المرستيمية . ويفصل المرستيم من القمة النامية المعقمة، وقد لا يستلزم تعقيمها إذا كانت مفصولة من نباتات معملية أو مرباة في صوبة.
2- إضافة مضادات حيوية للبيئة الغذائية
تضاف أحيانا بعض المضادات الحيوية للبيئة الغذائية مثل : Benomyl; Benolate بتركيز 10 ملليجرام / لتر لإيقاف نشاط الكائنات الدقيقة، وقد يسبب المركب Benomyl بعض الأضرار لنمو الأجزاء النباتية وتطورها. لذلك لا يفضل البعض إضافة مثل هذه المركبات للبيئة لاحتمال تفاعلها مع مكونات البيئة الغذائية وتكوين مركبات سامة للنموات، وقد يكون لها ضرر مباشر للريبوسومات مما يؤدى إلى تثبيط النمو. وقد تظهر طفرات في الكائنات الدقيقة مقاومة للمضادات الحيوية، كما أن المضادات الحيوية ليس لها تأثير على الفيروسات. ومن المركبات المستعملة :
Oxytetracycline; Tetracyclin; Penicilin - G; Streptomycin; Rifampicin; Achromycin; Chloromycin; Gentamycin; 8-Hydroxy-quinoline
الاكثر قراءة في الزراعة النسيجية
اخر الاخبار
اخبار العتبة العباسية المقدسة
