إنتاج نباتات أحادية في المعمل
In vitro Production of Haploids
الأعضاء المذكرة في النبات
هي مجموعة من الأسدية Stamens موجودة في الزهرة، وتتكون السداة من خيط Anther Filament. ويتكون المتك من فصين كبيرين مفصولين من الداخل بحاجز. ويحتوي كل فص على حجرتين يفصلهما نسيج فاصل. ويحتوي كل فص على كيس جرثومي بداخله حبوب اللقاح. وجميع خلايا الأنسجة الضامة والفاصلة بين حجرات وجدر المتك هي خلايا جسمية ثنائية العدد الكروموسومي. بينما حبوب اللقاح هي خلايا أحادية العدد الكروموسومي. وينتج عن الزراعة المعملية للمتك نباتات ثنائية مصدرها خلايا الأنسجة الضامة والفاصلة بالمتك ونباتات أحادية مصدرها حبوب اللقاح، وتنشأ حبوب اللقاح في المتك من خلايا أمية Pollen mother cells موجودة في الطبقات الداخلية لجدر الأكياس الجرثومية. وتنقسم الخلية الأمية انقساما اختزاليا Meiosis إلى خليتين أحاديتين Haploid ، ويسمى دور الخليتين Dyad . ويتبع ذلك انقساما عاديا Mitosis ليكون أربع خلايا أحادية، ويسمى دور الأربع Tetrad . وبذلك ينتج عن كل خلية أمية واحدة أربع حبوب لقاح. ثم تتفكك خلايا حبوب اللقاح (Pollen grains (Microspores جاهزة للتلقيح والإخصاب وحبة اللقاح خلية كروية أو بيضاوية أو مضلعة لونها أصفر غالبا لها جدار خارجي عادة سميك عليه تجاعيد وأشواك مميزة لكل نوع نباتي. وحبة اللقاح بداخلها مادة هلامية عكرة تحتوي على مواد غذائية في صورة حبيبات. وقبل انتثار حبوب اللقاح من المتك تنقسم نواة حبة اللقاح إلى نواتين تتميز إحداهما بكثافة السيتوبلازم المحيط بها وتسمى نواة جنسية Generative nucleus أو خلية تناسلية وتبقى صغيرة بدون جدار، بينما النواة الأخرى كبيرة وتسمى نواة خضرية Vegetative nucleus .
الأعضاء المؤنثة في النبات
يمثل المتاع Gynaecium عضو التأنيث بالزهرة في نباتات مغطاة البذور Angio sperms. ويتكون المتاع من كربلة واحدة أو عدة كرابل. وتتركب الكربلة Carpel من جزء قاعدي يعرف بالمبيض Ovary ويعلو المبيض خيط رفيع يعرف بالقلم Style، ويوجد في الطرف العلوي للقلم جزء منتفخ يسمى بالميسم Stigma. والميسم جسم كروي صغير وبرى أو أملس مغطى بطبقة لزجة لاقتناص حبوب اللقاح، ويحتوى المبيض على بويضة Ovule واحدة أو أكثر. وتقوم البويضة بوظيفة الخلية التناسلية الأمية، فيها ينشأ الجنين بعد الإخصاب أو هي الكيس الذي يحتضن الجنين بداخله. ولذلك تسمى البويضة علميا بالخلية الأمية للكيس الجنيني Embryo- sac mother cell مثلها مثل الخلية الأمية لحبوب اللقاح. وتتركب البويضة أساسا من نسيج النيوسيلة Nucellus محاطا غالبا بغطاء من الخارج متكون من غلاف أو غلافين ماعدا منطقة خاصة يتكون فيها النقير Micropyle وقد يكون نسيج النيوسيلة بدون اغلفة، وحيث إن البويضة وظيفتها تناسلية فلابد وأن تدخل في انقسام اختزالي (ميوزي) لتكوين خليتين Dyad ، ثم انقسام عادى (ميتوزي) للوصول إلى دور أربع الخلايا Tetrad ، وهي النتيجة النهائية للانقسام الاختزالي. وتحتوي كل من الخلايا الأربع على نصف العدد الأصلي من الكروموسومات. ثم تهضم ثلاث من الخلايا الأربع وتبقى خلية واحدة فقط في المبيض وتعتبر نواة أنثوية حقيقية تبدأ في تكوين الكيس الجنيني. وتنقسم النواة الأنثوية الحقيقية إلى ثلاث انقسامات بطريقة الانقسام العادي Mitosis ليتكون بعدها ثماني أنوية جميعها مختزلة، أي تحتوي على نصف عدد كروموسومات الخلية الجسمية. ويحدث بعدها توزيع للثماني أنوية في فراغ الكيس الجنيني، فتتجه ثلاث منها نحو أحد أقطاب الكيس الجنيني وتسمى بخلايا Antipodal. وتتجه ثلاث أخرى نحو القطب الآخر حيث تمثل خلية منهم الخلية الأنثوية الحقيقية True female egg وتسمى الخليتان بالخلايا المنشطة Synergetic cells. وتبقى نواتان من ثماني الأنوية، وهاتان تندمجان معا لتكونا نواة ثنائية العدد الكروموسومي وتسمى بالنواة المندمجة Fusion nucleus أو النواة القطبية Polar nucleus وبعد انتهاء هذا التوزيع يصبح الكيس الجنيني مؤهلا لاستقبال حبوب اللقاح. وزراعة البيضة معمليا قبل إخصابها يؤدى إلى إنتاج نبات أحادي العدد الكروموسومي. وبمضاعفة عدد الكروموسومات فيها تنتج نباتات مماثلة لنبات الأم. وزراعة المبيض أو البويضة أو الكيس الجنيني بجميع محتوياتهم سيؤدى إلى إنتاج نباتات مختلفة في عدد الكروموسومات، إذ يؤدى إلى إنتاج نباتات ثنائية من الخلايا الثنائية ونباتات أحادية من الخلايا الأحادية.
التلقيح والإخصاب
تنتقل حبة اللقاح إلى الميسم، وتسمى بعملية التلقيح Pollination. ثم تنبت حبة اللقاح مكونة أنبوبة لقاحية Germ tube تخترق نسيج الميسم ثم القلم متجهة نحو المبيض ثم الكيس الجنيني ثم البويضة. وعند بدء إنبات حبة اللقاح على الميسم أو قبل ذلك مباشرة تنقسم الخلية الجنسية (الذكرية) إلى خليتين Dyad. وعند وصول طرف أنبوبة اللقاح إلى البويضة تختفي عادة النواة الخضرية Vegetative nucleus ثم تفرغ أنبوبة اللقاح محتوياتها في الكيس الجنيني فتندمج إحدى الأنوية الذكرية مع البيضة (النواة المؤنثة الحقيقية)، ويسمى ذلك بالاندماج أو الإخصاب Fertilization ، وتنتج نواة الزيجوت Zygote التي تحتوي على عدد من الكروموسومات يساوى الموجود في الخلية الجسمية. أما النواة الذكرية الثانية فتندمج مع النواة المندمجة القطبية Polar nucleus وينتج عن هذا الاتحاد نواة واحدة هي نواة الإندوسبرم Endosperm تحتوي على ثلاثة أضعاف العدد الأساسي من الكروموسومات، لأنها تنشأ من اتحاد ثلاث أنوية تحتوي كل منها على نصف العدد الأساسي من كروموسومات الخلية الجسمية. وبانتهاء الإخصاب وتكوين الجنين (الزيجوت) واكتمال نمو الجنين يكون قد اكتمل تكوين البذرة.
تعريف النباتات الأحادية Haploid plants
يعرف النبات الناتج من الطور الجرثومي porophyte (حبة لقاح أو بيضة) بأنه نبات أحادي Haploid عقيم تحتوي خلاياه على نصف العدد الكروموسومى الموجود في الخلية الجسمية والنبات الأحادي قد يكون مصدره حبة لقاح ويسمى نشوءا ذكريا Androgenesis، أو مصدره بيضة غير مخصبة ويسمى نشوءا أنثويا Genogenesis أو نشوءا بكريا Par- thenogenesis; Apomixes. وتضاعف عدد الكروموسومات في النباتات الأحادية يؤدى إلى إنتاج نباتات متضاعفة Polyhaploids أي إنها نباتات متضاعفة ومصدرها نباتات أحادية. وهي نباتات خصبة منتجة للبذور. وبدأت تجارب زراعة المتوك عام 1970 على الأرز والقمح في الصين، ثم امتدت التجارب إلى الذرة والشوفان والتريتيكال والتبغ والقطن وفول الصويا والشلجم والكرنب الصيني والفلفل وبعض الأشجار والشجيرات وكثير من نباتات الزينة. وشملت زراعة المتوك وحبوب اللقاح الآن أكثر من 171 نوعا نباتيا ينتمون إلى 60 جنسا و 26 عائلة نباتية. ومازالت تحتاج إلى مزيد من البحث لحل بعض الصعوبات التي تواجه إنتاج النباتات الأحادية لبعض المحاصيل.
أهمية النباتات الأحادية
1- إنتاج سلالات نقية
يمكن الحصول على سلالات نقية بطرق تقليدية تشمل التهجين والتلقيح الذاتي أو الرجعي لعدة أجيال مع الانتخاب للتخلص من الصفات غير المرغوبة. ويؤخذ على هذه الطريقة أنها تحتاج إلى مجهود وفترة زمنية طويلة بينما زراعة المتوك أو حبوب اللقاح أو البيضة في المعمل يمكن إنتاج نباتات أحادية العدد الكروموسومي Haploid ، فإذا عوملت النبتات المعملية الأحادية بالكولشسين يتضاعف عدد الكروموسومات فيها وتنتج سلالات ثنائية Dihaploid خصبة متجانسة Homozygous وثابتة وراثيا Isogenic في وقت قصير. وقد أنتجت سلالة ذرة "Qun-Hua بزراعة المتوك في فترة تقل عشر سنوات بالمقارنة بإنتاج سلالة مماثلة في التجانس بالطرق التقليدية.
وتميزت هذه السلالة بارتفاع المحصول وقدرة عالية على التوافق الهجيني حيث أدخلت في إنتاج 62 هجينا، تميز منها 56 هجينا بارتفاع المحصول، وقد تفوق الهجين x Hua) Qun 411) عليهم جميعا (1980 ,W, et al) .
2- استحداث تنوع وراثي في النباتات الأحادية المتضاعفة
نباتات الأرز الناتجة من الجيل الأول F1 للهجين 5675 Jili x Xian nong هي نباتات ثنائية غير متجانسة لأنها تحتوي على جينات متجمعة من الصنفين. وبالزراعة المعملية لحبوب لقاح الجيل الأول (F1) نتجت نباتات في الجيل الأول (H1) مختلفة في تركيبها الوراثي . وبمضاعفة العدد الكروموسومي لهذه النباتات ظهرت 7 تكوينات وراثية، بعضها يحمل صفات الصنف الأول وبعضها يحمل صفات الصنف الثاني، والبعض الآخر جمع بين صفات الصنفين Institute of genetics (1974, 1977b)
شكل يبين مقارنة بين برنامج تربية نباتات أحادية وبرنامج تربية تقليدية
3- استحداث أصناف جديدة من الأرز والقمح والتبغ
بزراعة متوك الجيل الأول الهجين (F1) من الأرز والقمح والتبغ تم الحصول على :
(أ) صنفين من الأرز هما (1.Hua Yu No) و (2 .Hua Yu No) يتميزان بمحصول مرتفع من الحبوب ( 7500 كيلوجرام / هكتار) ومقاومة اللفحة البكتيرية Bacterial blight والتأقلم للبيئة بدرجة عالية، وصنفين آخرين هما (Xin Xiu) و (Tang Huo No-2) يتميزان بارتفاع المحصول (1978 ,Chen and Li) .
(ب) سلالة جديدة من القمح الشتوي تسمى (2288-Jingdan) تتميز بسنابل كبيرة وارتفاع محصول الحبوب وقوة نمو الأشطاء ومقاومة مرض الصدأ المخطط Stripe must والبياض الدقيقي Powdery mildew وقصر الساق ومقاومة الرقاد (Institute of genetics, China, 1977b) .
(ج) الصنف (1.Danyu No) من التبغ متفوق بجدارة على آبائه في المحصول ومقاومة الأمراض. واستغرق 3 سنوات من زراعة حبوب لقاح الجيل الأول الهجين حتى تم توزيعه على المزارعين (1974 ,Institute of Tobacco, Shantung, China).
4- رفع كفاءة الانتخاب للصفات المتنحية
تحتوي النباتات الأحادية على طاقم واحد من الكروموسومات، لذلك فإنها ثابتة وراثيا أي إن صفاتها السائدة تظل سائدة والمتنحية تظل متنحية، والتعبير الوراثي للصفات الوراثية شديد التباين فمثلا تهجين الصنف 62 - Sonora من القمح ذات الحبوب الحمراء مع الصنف Hongtu ذات الحبوب البيضاء كانت حبوب الجيل الأول (1F) الناتجة حمراء اللون، لأن اللون الأحمر سائد على اللون الأبيض. وفى الجيل (F2) تم الحصول على 413 نبات منهم 313 نبات حبوبه حمراء و 100 نبات حبوبه بيضاء، وكانت نسبة الانعزال (3،1 : 1) . وأوضحت هذه التجربة أن تربية النباتات الأحادية من الممكن أن ترفع كفاءة الانتخاب للصفات المتنحية مع سهولة التخلص من الكايميرا (1977,1974 Institute of genetics ).
5- إنتاج نباتات مذكرة
يمكن الحصول على نباتات مذكرة من الذرة والأسبرجس Asparagus. وتتميز نباتات الأسبرجس المذكرة على النباتات المؤنثة في إنتاج محصول المهاميز (الطرف القمي من الساق وهو الجزء الصالح للغذاء)، كما أن النباتات المذكرة تعمر أطول من النباتات المؤنثة (1980 ,Wu, et al).
6- سهولة استحداث الطفرات في المزارع الأحادية
يعتمد نجاح تحسين أي محصول على مقدار التغييرات الوراثية المتوفرة مع انتخاب الأفضل من هذه التغييرات. ويعتبر الإشعاع والمطفرات الكيميائية وسائل ناجحة في إحداث تباينات وراثية. وتعتبر مزارع الكالس الغنية بالسيتوكاينينات مصدرا هاما أيضا للحصول على تباينات وراثية وتيسر زراعة الخلايا الأحادية دراسة وراثة الخلايا الجسمية، لأنه في بعض الحالات قد تكون للطفرة الخلوية Mutant cell lines أهمية خاصة. والطفرات الناتجة من معظم الخلايا الأحادية ليس لها تعبير جيني لأنها طفرات متنحية. ويمكن استخدام خلايا الكالس أحادية العدد الكروموسومي في دراسة تأثير بعض المطفرات مثل الإشعاع والكيماويات، وقد تميزت في ذلك الخلية الأحادية وحبوب اللقاح على المتوك، حيث تؤدى زراعة المتوك إلى إنتاج نباتات أحادية Haploids بجانب نباتات مختلفة التضاعف. وتستخدم مزارع الخلايا الأحادية ومزارع البروتوبلاست بنجاح في عزل خلايا طافرة Mutant cell lines لأنواع نباتية عديدة مقاومة للمضاد الحيوي ستربتومايسين وطفرات مقاومة لمركب (Maliga et al., 1973) 5-BrQmodeoxy-uridine وطفرات مقاومة لمركب-Me thionine sulfoximine وطفرات مقاومة لنيماتودا البطاطس وطفرات مقاومة لدرجات حرارة مختلفة (1981 ,Wenzel and Uhrig) كذلك تم الحصول على طفرات بتعريض نبتات تبغ حديثة العمر ناتجة من زراعة المتوك، إلى جرعات من 1,5 إلى 3 كيلوراد من أشعة جاما . وأظهرت هذه الطفرات نسبة عالية من التغييرات الوراثية في الشكل والحجم ولون الزهرة وبعضها كانت كايميرا مؤكدة. ونتجت طفرة أزهارها بيضاء بعد زراعة متوك نبات التبغ على بيئة مضاف إليها 10-6 مولر من مادة N-3-Nitrophenyl-N-Phenylurea Nitsch Nitsch and Nitsch, 1969)) وقام (1971) Devreux and Sac-cardo بتعريض براعم زهرية للصنف Virginia Bright من التبغ Nicotiana tabacum إلى الجرعة واحد كيلوراد من أشعة -X ، ثم زرعت المتوك بعد فصلها من الأزهار المشععة على بيئة غذائية وكانت النتيجة أن ظهرت تشوهات كروموسومية بنسبة 6%. كذلك بتطبيق زراعة المتوك أمكن استحداث تغييرات وراثية في العديد من النباتات وانتخبت سلالات منها وأصبحت بعد ذلك أصنافا تجارية. فمثلا في الصين استحدثت أصنافا جديدة من الأرز تسمى Yin, et al., 1976) Tanrong-1) و 2-Huagu و 1-Huagu ومن القمح تسمى 1-Huaper-1 Lunghua ومن التبغ تسمى 1-Tanya - Tanyu-2 (Hu, et al., 1978) Tanyu. وفي اليابان استحدث صنف 211 F- من التبغ مقاوم للذبول البكتيري من خلال زراعة المتوك.
إنتاج نباتات أحادية من حبوب اللقاح
أهمية زراعة حبوب اللقاح
1 - يفضل زراعة حبوب اللقاح لتجنب الصعوبات الناتجة عن صلابة جدر متوك بعض الأنواع النباتية.
2- النباتات الناتجة من حبوب اللقاح متجانسة بعد تضاعف كروموسوماتها بالكولشسين، ولا ينتج عنها انعزالات وراثية، وأن حوالي 90٪ من السلالات الناتجة هي سلالات ثنائية لها تعبير جيني متجانس. بينما النباتات الناتجة من زراعة المتوك تحتوي على نباتات أحادية مصدرها حبوب اللقاح ونباتات ثنائية مصدرها جدر المتك والأنسجة الضامة به.
3- تعطى حبوب اللقاح جنينا ذكريا مباشرة. وهذا يسهل الدراسة وتتبع التغيرات الوراثية والفسيولوجية والبيوكيميائية للأجنة الذكرية الناشئة مثل متابعة مراحل تكوين الأجنة من حبوب اللقاح ابتداء من تكوين الخلية الفردية Uninucleus ، ودراسة الامتصاص Uptake والتحور الوراثي Transformation وتأثير المطفرات مثل المطفرات الكيميائية والفيزيقية مثل أشعة جاما وأشعة X.
خطوات زراعة حبوب اللقاح Pollen grains culture
فصل حبوب اللقاح
1 - بالنسبة للأزهار الكبيرة مثل أزهار الداتورا Datura innoxia والبيتونيا - Pe unia hybrida ، تفصل حبوب اللقاح من متوك طازجة. وتتم هذه الخطوة داخل كابينة معقمة.
2- بالنسبة للأزهار الصغيرة، تعقم البراعم الزهرية أو النورات تعقيما سطحيا. وتفصل المتوك وتوضع في الدورة الزجاجي الخاص بجهاز المجنس Homogenizer يحتوى على بيئة سائلة ، ويفضل استخدام دوارق زجاجية نوع Potter-Elvehjem ، وبذلك يمكن الحصول على حبوب لقاح معلقة في بيئة سائلة ومعها بقايا جدر المتك. ومن الضروري بالنسبة لنبات التبغ Nicotiana tabacum زراعة المتوك في بيئة سائلة لمدة 4 - 6 أيام قبل فصل حبوب اللقاح. ويرشح المحلول لفصل حبوب اللقاح عن بقايا جدر المتك، ويستخدم لذلك قماش نايلون مساميته دقيقة تسمح بمرور البيئة السائلة ومعها حبوب اللقاح فقط.
3- توضع حبوب اللقاح المعلقة في بيئة سائلة في جهاز طرد مركزي يعمل بسرعة (g.x10) لمدة أربع دقائق. ثم يتم التخلص من معظم البيئة السائلة إلا القليل منها المحتوى على حبوب لقاح متجمعة . ثم يضاف إليها بيئة سائلة طازجة لغسل حبوب اللقاح. وتكرر هذه الخطوة عدة مرات مع الحرص على إضافة بيئة جديدة طازجة كل مرة لضمان حسن غسل حبوب اللقاح.
4- تنقل حبوب اللقاح مع كمية بسيطة من البيئة السائلة إلى دوارق الزراعة المعملية المحتوية على بيئة سائلة طازجة، وقد تستخدم بيئة صلبة طازجة بدلا من البيئة السائلة ويفضل في حالة الزراعة في بيئة سائلة استمرار تحريك دوارق الزراعة بصورة بطيئة لضمان انتشار حبوب اللقاح فيها، وإن كانت عملية تحريك دوارق الزراعة ليست ضرورية مع بعض النباتات مثل Datura والتبغ Nicotiana.
تحفيز حبوب اللقاح
1- ثبت أن غياب منظمات النمو من البيئة يؤدى إلى تحفيز حبوب اللقاح لتكوين أجنة ، بينما إضافتها للبيئة يؤدى إلى تكوين قليل من الكالس بجانب الجنين.
2- لزراعة حبوب لقاح التبغ Nicotiana tabacum تستخدم بيئة تحتوى على أملاح العناصر المعدنية المذكورة في بيئة Bourgin and Nitsch, 1967 (H) مضافا إليها الحديد لتحفيز حبوب اللقاح على النمو. ثم تنقل حبوب اللقاح بعد ذلك إلى بيئة طازجة مضافا إليها 800 ملليجرام / لتر جلوتامين Glutamine +100 ملليجرام / لتر سيرين Serine + 5000 ملليجرام / لتر إينوسيتول Myo-Inositol + أملاح العناصر المعدنية بقدر يعادل أربعة أمثال تركيزها الأساسي في البيئة الغذائية (H) (جدول 1).
3- يمكن دفع حبوب لقاح الداتورا Datura innoxia للنمو بزراعتها في بيئة تحتوي على أملاح العناصر المعدنية + 2٪ سكروز ثم تحضن عند 25 - 30 م، ويبدأ انقسام الخلايا بعد 24 ساعة من الزراعة. وبعد 72-96 ساعة يزداد انقسام الخلايا ويبدأ تخصصها وتكوين أجنة ثم تنمو الأجنة إلى نباتات.
4- يزداد نشاط تكوين الأجنة من حبوب اللقاح أو المتوك كثيرا برفع تركيز السكروز و Myo-Inositol في البيئة، حيث إن زيادة تركيز السكروز من 0.088 إلى 0,18 مولر من العوامل الهامة لخروج النبتات من حبوب اللقاح والمتوك وله تأثير جيد على النمو وينظم الضغط الأسموزي للبيئة.
5- التركيزات المرتفعة من أيونات الأمونيوم Amonium توقف تكوين الكالس الناتج من حبوب لقاح الشعير والأرز. وتحتوي بينة (N6) على نسبة منخفضة من الأمونيوم وزيادة أيونات النيترات Nitrate. لذلك تعتبر بيئة (N6) هي أكثر البيئات كفاءة بالمقارنة ببعض البيئات الأخرى المستخدمة في زراعة متوك الأرز والنجيليات الأخرى (1975 ,.Chu et al (جدول 2 و3).
6- يضاف أحيانا مستخلص درنات البطاطس إلى بيئة «Mille's medium» لزراعة متوك التبغ. واستحدثت بيئة Potato II medium»» تحتوى على 10٪ مستخلص بطاطس + 50٪ من قوة العناصر الكبرى للبيئة «WH» + أملاح حديد + ثايمين Thiamine بالتركيز المذكور في بيئة (MS). وزيادة نسبة الثايمين في هذه البيئة يشجع إنتاج
الكالس b) 1977,Institute of Genetics) (جدول 4) .
جدول (1) المكونات الأساسية لبيئات غذائية خاصة بزراعة المتوك وحبوب اللقاح (ملليجرام / لتر)
جدول (2) محتوى بيئة (N6) من العناصر والحديد والسكروز والاحماض الامينية لزراعة متوك وحبوب لقاح الجيليات (Chu, 1978)
جدول (3) محتوى بيئة (N6) من الاكسينات والسيتوكاينينات لزراعة متوك وحبوب لقاح النجيليات
c.f. Chu, 1978 * LH= Lactalbumin hydrolysate
جدول (4) مكونات بيئة البطاطس Potato ll medium لزراعة متوك القمح
طرق زراعة حبوب اللقاح
تزرع حبوب اللقاح مباشرة في أطباق بترى مثل زراعة الخلايا الفردية ويمكن زراعتها معلقة في بيئة سائلة. وتستخدم إحدى الطرق الآتية لزراعة حبوب اللقاح وتكوين أجنة ذكرية Androgenesis .
1- طريقة الزراعة الحاضنة Nurse culture technique
تستخدم هذه الطريقة لزراعة حبوب لقاح نبات الطماطم Lycopersicon esculentum. حيث توضع المتوك على سطح البيئة الغذائية الأساسية الصلبة في أطباق بترى ثم تغطى بقرص صغير من ورق الترشيح ثم تضاف قطرات من البيئة الغذائية المعلق بها حبوب اللقاح على أقراص ورق الترشيح بمعدل 10 حبوب لكل قرص. ثم تحضن البيئة ومحتوياتها عند 25 م مع وجود ضوء مستمر. وبعد 28 يوما تقريبا تظهر عناقيد من خلايا خضراء بنسبة 60٪ من حبوب اللقاح المنزرعة، وهي مستعمرات خلوية أحادية العدد الكروموسومي وثبت من هذه التجربة أنه لا يمكن إنتاج الخلايا الخضراء في حالة زراعة حبوب اللقاح بدون وجود المتوك في البيئة الغذائية. وبالرغم من نجاح هذه الطريقة في زراعة حبوب لقاح نباتات الطماطم، إلا إن تطبيقاتها العملية ما زالت قاصرة على بعض الأنواع النباتية (1972 ,.Sharp, et al).
2- طريقة القطرة المعلقة Hanging drop
تستخدم هذه الطريقة لزراعة حبوب لقاح الكرنب Brassica oleracea وحبوب لقاح الهجين Kameya and Hinata1970) B. oleracea, x B. alboglabra) ومضمونها :
- توضع قطرة من البيئة الغذائية مضاف إليها ماء جوز الهند تحتوي القطرة على 50-80 حبة لقاح، على غطاء شريحة زجاجية Cover ثم يوضع هذا الغطاء مقلوبا على شريحة زجاجية مقعرة.
- يفضل تثبيت عمود صغير من شمع البرافين وسط الشريحة المقعرة، ثم يثبت غطاء الشريحة الحامل للقطرة المعلقة مقلوبا على الشريحة المقعرة، ثم تثبت الشريحة المقعرة مع غطاء الشريحة بشمع البرافين وترج الشريحة بحركة دائرية لتحسين التهوية. وبعد أربعة أسابيع تتكون عناقيد من الخلايا المنبثقة من حبوب اللقاح.
3- طريقة نيتش Nitsch, 1974; 1977 method
تستخدم هذه الطريقة لزراعة حبوب لقاح التبغ Nicotiana tabacum وتشمل الخطوات التالية :
- تفصل المتوك وتزرع في بيئة سائلة تحت ظروف معقمة. ثم تحضن لمدة أربعة أيام عند 27م، بعدها تستخلص حبوب اللقاح من المتوك بواسطة جهاز المجنس Homogenizer ، وتنقل إلى بيئة سائلة تحتوي على KNO3 (8.9 ملليمون + NH4NO3 (8.9 ملليمون) + MgSO4,7H2O (0.75 ملليمون) + CaCL2 (1.42 ملليمول) + H2PO4 (0.5 ملليمولن) + FeEDTA (100 ملليمول) + Glutamine (5.5 ملليمونس) + Serine (0.95 ملليمونس) + Myoinositol (0.03 مول) + - Ze-atin (0.046 ميكرومولر) + (Indole Acetic Acid (LAA (0.57 ميكرومولر) + Sucrose (0.06 – 0.23 مولر).
- يرشح معلق الخلايا لفصل البيئة السائلة المحتوية على حبوب اللقاح والتخلص من بقايا جدر المتك، ثم يعامل الراشح المحتوى على حبوب اللقاح بالطرد المركزي لتكوين تجمعات عنقودية من حبوب اللقاح. ثم تفصل حبوب اللقاح وتغسل مرتين ببيئة سائلة باستخدام جهاز الطرد المركزي.
- تنقل حبوب اللقاح إلى بيئة سائلة طازجة لتكوين معلق خلايا كثافته حوالى 5000 حبة لقاح/ ملليلتر.
- توزع أحجام متساوية (2 ملليلتر) من معلق الخلايا في طبقات رقيقة في أطباق بترى صغيرة أو دوارق سعة 25 ملليلتر. وتستخدم طريقة Bajaj ,1978a التالية إذا كان حجم معلق حبوب اللقاح صغيرا جدا.
4- طريقة باجاج Bajaj (1978a) method
- توضع قطرة من السليكون في وسط طبق بترى معقم من البلاستيك قطره 5 سنتيمتر.
ثم يوضع غطاء شريحة مقاس 22 × 22 ملليمتر بحذر فوق قطرة السليكون.
- توضع قطرة 250 - 500 ميكرولتر من معلق حبوب اللقاح فوق غطاء الشريحة باستخدام ماصة ميكرومترية. وتغطى الأطباق بواسطة غشاء Parafilm - M ، ثم تحضن لمدة 4 - 6 أيام تحت ضوء ضعيف (500 لكس).
- تحضن الأطباق عند 14 ساعة ضوئية يوميا وشدة ضوئية 2000 لكس وحرارة 28 م وتبقى حتى النهاية.
عوامل إنجاح زراعة حبوب اللقاح
1- غسل حبوب لقاح نباتات التبغ والداتورا جيدا بعد فصلها من المتوك خطوة هامة للتخلص من المواد المانعة لإنباتها، وتعريضها للبرودة قد يؤدى إلى انقسام میتوزي Mitosis طبيعي وتكوين أنوية خضرية وتناسلية طبيعية وزيادة حيويتها، وقد تسبب تشوهات في الانقسام الميتوزي الأول وتثبيط مراحل تطور الجاميطات واختلاف في إنتاج الأجنة الذكرية. ولذلك يوصى بعدم تعريض حبوب اللقاح للبرودة (1978 Bajaj,)
2- تتكون الأجنة الذكرية من حبوب اللقاح المفصولة من نبات التبغ عند أية مرحلة من مراحل نمو حبوب اللقاح ابتداء من مرحلة وحيدة النواة Uninucleus والانقسام الميتوزى الأول First mitosis حتى الطور الأخير من تكوين النواتين Late binucleus، وتنخفض نسبة النجاح بدرجة كبيرة كلما تقدمت حبوب اللقاح في العمر. وزراعة حبوب اللقاح وهي في مرحلة متوسطة أو متأخرة من النمو وعندها تحتوي على نوية واحدة Mid- or late- Uninucleus microspores تؤدى إلى الحصول على أفضل عائد من النباتات الأحادية وحيث إن المتك الواحد يحتوي على جميع أطوار النمو المختلفة لحبوب اللقاح، ابتداء من مرحلة الخلايا الأمية المنشئة لحبوب اللقاح حتى مرحلة حبوب اللقاح كاملة النضج، فإن ذلك يؤكد إلى وجود تباين شديد في النباتات الناتجة من زراعة المتك. وقد تأكد ذلك بزراعة متوك القمح ومحاصيل أخرى (1980 He and Ouyang) .
جدول (5) طور نمو حبوب اللقاح المناسب للزراعة المعملية
2- زراعة المتوك Anther culture
نباتات يمكن إكثارها بزراعة المتوك
تتميز طرق الزراعة المعملية للمتوك بأنها بسيطة نسبيا وسريعة ولها كفاءة عالية في إنتاج نباتات أحادية.
وأمكن إنتاج نباتات أحادية بزراعة متوك أو نباتات أحادية أو أنسجة أحادية لنباتات عديدة مثل:
Brassica campestris; Brassica oleracea; Brassica pekinensis; Brassica chi-nensis
Lycopersicon spp.; Lycopersicon esculentum; Datura innoxia; Datura spp.;
Luffa echinata; Luffa cylindrica; Capsicum annum; Capsicum frutescens; Citrus limon; Citrus medica; Festuca arundinacea; Festuca pratensis; Nicotiana spp.; Populus spp.; Arachis spp.; Hyoscyamus spp.; Freesia spp.; Glycine max; Asparagus officinalis; Beta vulgaris; Fragraria virginiana; Sorghum vulgare; Saccharum sinensis; Tritical; Triticum aestivum; «T.acstivum x Agropyron glaucum»; Vicia faba; Vitis vinifera: Zea mays. Arabidopsis thaliana; Anemone spp.; Agropyron repens; Atropa bella- donna
Cassia fistula; Coffca arabica; Digitalis purpurea; Gladiolus; Hordeum vul gare; Lilium spp.; Linum usitatissimum; Lotus corniculatus;
فصل وزراعة متوك نبات التبغ
نبات التبغ من الأمثلة النموذجية لإنتاج نباتات أحادية. وتنتخب المتوك غير الناضجة لضمان احتوائها على حبوب لقاح وحيدة النواة Uninucleus وهي في مرحلة ما قبل الانقسام الميتوزى الأول (1980 ,Zhou and Yang). ويمكن إجراء الآتي لإنتاج أجنة ذكرية Androgenesis.
1- تعقم البراعم الزهرية في محلول هیبوکلوريت صوديوم بتركز 1 % (وزن/ حجم)، أو محلول كلوركس تجاري Clorox بتركيز 5% (حجم/ حجم). ثم تغسل البراعم مرتين بماء مقطر معقم مرتين. وإذا فصلت البراعم الزهرية من نباتات نامية داخل صوبة محمية فلا تحتاج إلى تعقيم.
2- تفصل المتوك بإحداث شق من جانب واحد من البرعم الزهري. ثم يضغط على الأسدية برفق لفصلها. ثم تفصل المتوك بحذر تام حتى لا يحدث أي ضرر لها، وتستبعد المتوك التي حدث لها ضرر أثناء فصلها لأنها تميل عادة إلى تكوين كالس. ثم تجمع في طبق بترى معقم وتزرع مباشرة على بيئة غذائية صلبة.
3- تزرع المتوك بمعدل 5-10 متوك في الدورف المخروطي مع مراعاة كثافة الزراعة المناسبة.
الاحتياطات اللازمة لفصل وزراعة المتوك
1- تعتبر البراعم الزهرية المقفولة بعد تعقيمها سطحيا مصدرا جيدا للمتوك. حيث تزال أوراق الكأس والتويج بحذر، مع الحرص بعدم وصول مواد التعقيم إلى المتوك لتفادى الضرر الذي قد يحدث. وفى نباتات العائلة النجيلية مثل القمح والشعير تعقم السنبلة وهي مازالت متصلة بحامل السنبلة ثم تفصل السنبلة بعد تعقيمها.
2- يفصل المتك تحت ميكروسكوب إذا كان البرعم الزهري صغيرا مثل نباتات Asparagus وBrassica . ويتم ذلك بإزالة غلاف الزهرة Perianth فقط، والإبقاء على باقي أجزاء البرعم على اتصال مع الأسدية. ولا يؤثر وجود بقايا أجزاء الزهرة في البيئة الغذائية على طبيعة نمو حبوب اللقاح الموجودة داخل المتوك.
3- في حالة الأزهار والمتوك كبيرة الحجم تزال الأسدية Stamens بأكملها مع الخيط الحامل لها، ثم توضع في وضع أفقي ويفصل المتك من الخيط Filament بدقة وحرص. حيث لا تنتقل المواد الغذائية من البيئة الغذائية إلى المتك خلال الخيط وقد يسبب وجوده منع نمو حبوب اللقاح.
4- تزرع المتوك بعد فصلها مباشرة على بيئة مناسبة صلبة أو سائلة، بحيث يكون هناك اتصال مباشر بينها وبين البيئة الغذائية بما يضمن وصول المواد الغذائية إلى حبوب اللقاح. وزراعة المتوك في بيئة سائلة يجعلها تطفو على سطحها، لذلك يستلزم تثبيتها على جسر من ورق الترشيح.
5- بالنسبة للأزهار الكبيرة يمكن الحصول على كثافة جيدة من حبوب اللقاح بزراعة متك واحد/ ملليلتر بيئة سائلة، حيث تعطى هذه الكثافة حوالي 5 x 10 4 حبة لقاح / ملليلتر بيئة في نبات Datura innoxia 4 × 10 4 حبة لقاح / ملليلتر بيئة في نبات Nicotiana tabacum. ويمكن زيادة عدد المتوك/ ملليلتر في البيئة السائلة بالنسبة للبراعم الزهرية الصغيرة للحصول على نفس الكثافة تقريبا.
6- تنبت حبوب اللقاح بعد 3 - 4 أسابيع من زراعة المتوك منتجة نبيتات أحادية لا تشابه النباتات الثنائية المأخوذة منها. وقد ينتج المتك الواحد أعدادا كبيرة من النبتات ويفضل فصلها عن بعضها مباشرة بعد تفتح المتك. وفصل النبيتات في هذه المرحلة المبكرة يساعد على فصلها ونقلها بسهولة إلى بيئة طازجة جديدة، بينما يؤدى التأخير في فصل النبتات إلى تداخل وتشابك جذورها داخل المتك المتفتح مما يؤدى إلى تكوين كالس وتكوين أعداد أخرى من الأفرع.
7- تنقل النباتات ذات المجموع الجذري الجيد إلى عبوات تحتوي على بيت موس ورمل. ويجب إزالة آثار الأجار جيدا من الجذور قبل النقل. ثم تنقل النباتات للصوبة لتبقى تحت الري الرزازي (الضبابي) Mist irrigation لمدة عشرة أيام لإتاحة الفرصة لتكوين مجموع جذري يقوم بوظيفته جيدا.
البيئة الغذائية المناسبة لزراعة المتوك
تستخدم بنجاح بيئات White, 1963, Murashge and skoog, 1962 Nitch ,1969 Nitschm وغيرها من البيئات المشتقة منهم في الزراعة المعملية لمتوك الدخان وقد أدخل عليها بعض التطويرات. ويعتبر الحديد من العناصر الهامة المضافة لبيئة المتوك. وتصنف الأنواع النباتية كالتالي :
1- أنواع نباتية لا تحتاج منظمات نمو
تعتبر بيئة (Murashige and Skoogc, 1962 (MS والإضافات التي أحدثها (1967) Nitsch أساسية لزراعة متوك وحبوب لقاح هذه المجموعة من النباتات. وإضافة الفيتامينات والحديد والسكروز لهم أهمية في تحفيز نمو وتكوين النبتات من حبوب اللقاح أو الكالس ولا تحتاج هذه المجموعة إلى منظمات نمو. وتتميز حبوب اللقاح فيها أنها ثنائية الخلية Bicellular. وتضم هذه المجموعة الأنواع النباتية الآتية:
Datura innoxia; Hyoscyamus niger; Petonia hybrida; Nicotiana tabacum; N. sylvestris; N. panculata; N. knightiana.
وإضافة الفحم النباتي النشط تحت البيئة الصلبة في وعاء زراعة المتوك يساعد على تكوين كالس جيد وإنتاج أعداد كبيرة من النبتات لقدرته على امتصاص المركبات المثبطة للنمو والمواد الضارة التي يفرزها جدار المتك (1974 1972 ,Nitsch) . والتركيز الأمثل للسكروز هو 0,26 مولر في بيئة متوك القمح و 0,35 مولر لمتوك الذرة. ويفضل زيادة السكروز في بيئة متوك النجيليات بوجه عام من 2-4% إلى 8 - 12 % ، وزيادة السكروز في بيئة متوك نباتات Barley و Tritical ,Rapeseed من 0,18 إلى 0,35 مولر 1978 Chen and Li ويبين جداول (2 و 3) البيئات المناسبة لزراعة حبوب اللقاح ومتوك النجيليات.
2- أنواع نباتية تحتاج إلى منظمات نمو
تضاف منظمات النمو إلى بيئات متوك وحبوب لقاح هذه المجموعة من النباتات، وتختلف احتياجاتها باختلاف النوع والصنف النباتي وتحتوي هذه الأنواع على حبوب لقاح ثنائية Bicellular أو ثلاثية Tricellular الخلايا، مثل الأنواع التابعة للأجناس Trinical; Triticum, Oryza; Hordeum . ويتكون الكالس إذا زرعت متوك هذه النباتات. وقد تنتج أجنة تنمو وتكون نباتات مثل Brassica Asparagus officinalisg campestris. والأوكسينات هي أهم الهرمونات المؤثرة في طبيعة نمو المتوك، وحاجتها من السيتوكاينين ومنظمات النمو الأخرى أقل كثيرا من حاجتها للأوكسينات. ومن الأكسينات مركبات عديدة أهمها :
-3Indole Acetic Acid (IAA). 3-Indole Butaric Acid (IBA). Naphthalene Acetic Acid (NAA). 2,4,5-Trichlorophenoxy Acetic Acid (2,4,5-T). 2,4-Dichloro- phenoxy
Acetic Acid (2,4-D). 4,4-Chlorophenoxy Acetic Acid (CPA).
4-Amino- 3,5,6-Trichloropicolinic Acid (Pichloram or TCP)
ومن السيتوكاينينات مركبات عديدة أهمها :
-6 Benzyl Amino Purine (BAP). 6-Benzyl Adenine (BA).
Isopentenyl Adenine (IPA). 6-y-y-Dimethyl ally Amino Purine (2 ip).
-5 (4-Hydroxy-3-Methyl-trans-2-Butenylamino) Purine (Zeatin).
-6Furfuryl - Amino Purine (Kinetin = KIN).
والأنواع النباتية التي تحتوي متوكها على حبوب لقاح ثلاثية الخلايا Tricellular تحتاج إلى إضافة سكروز بنسبة 5 - 15%. بينما الأنواع التي تحتوي متوكها على حبوب لقاح ثنائية الخلايا Bicellular فيضاف السكروز بنسبة 2-5 % والسكروز له تأثير منظم للضغط الأسموزي في البيئة الغذائية والتركيز العالي للسكروز ضروري جدا لتحفيز متوك نبات Brassica campestris للنمو، حيث يضاف بتركيز 10 % للبيئة + 0.1 ملليجراملتر من كل من NAA 2,4-D . ويضاف السكروز بتركيز 12% إلى بيئة متوك نبات الشعير Hordeum vulgare وبتركيز 6 - 9 % إلى بيئة الأجناس Triticum; Tritical Oryza مضاف إليه 2 ملليجراملتر 2,4-D وبتركيز 12% لمتـوك الذرة Zca mays مضاف إليه 2 ملليجرام / لتر من Kinetin, 2,4-D. وتعتبر المكونات الأساسية لبيئة (MS) هي الأفضل للأجناس Triticals, Zea و Triticum . والبيئة (Miller (M قبول واسع في زراعة متوك الأرز ومتوك نباتات أخرى دون غيرها من البيئات وقد حدثت بعض التغييرات على بيئة (Miller (M مثل زيادة تركيز النترات وتخفيض الأمونيوم، وعرفت هذه البيئة بعد تحديثها بالرمز (MM)، وتستخدم خاصة لزراعة متوك نبات Brassica campestris ويضاف مستخلص الخميرة وماء جوز الهند ومستخلص البطاطا والأحماض الأمينية Gluta mine و Asparagine إلى مكونات البيئة (MM) لزيادة معدل نمو الكالس من حبوب اللقاح وتكشفه إلى أجنة ويتم إنتاج النباتات من الكالس بإضافة تركيزات مختلفة من الهرمونات، وتخفيض السكروز إلى 3-2 %. وبتقدم عمر الكالس تنخفض قدرته بشدة على إنتاج نباتات كاملة . كذلك يمكن تغيير نوع وتركيز أملاح العناصر الغذائية في البيئة. ويفضل قبل نقل النباتات الصغيرة من البيئة الغذائية إلى التربة أن تسبقه الزراعة في بيئة سائلة ضعيفة تحتوي على أملاح العناصر الغذائية المذكورة في بيئة 1963 ,White + سكر مختزل بتركيز 0,5 - 1 %.
تحضين المتوك وحبوب اللقاح
تحضن المتوك وحبوب اللقاح بعد زراعتها عند 24 - 280 م. وارتفاع الحرارة عن 30 م تسبب اختلافا كبيرا في إنتاج ونمو الكالس وعدد النباتات الناتجة منه. وكان ذلك مؤكدا بالنسبة لنباتات القمح ولفت الزيت. وأن النباتات المعملية الناتجة من متوك القمح المفصولة من سنبلة الفرع الرئيسي كانت أكثر من سنابل الأفرع الجانبية (1982Hu, et al, ). وتعريض متوك القمح والأرز ومحاصيل نجيلية أخرى لحرارة منخفضة 1 - 4 م لمدة 48 ساعة قبل زراعتها يؤدى إلى زيادة تكوين الكالس وزيادة الاختلافات ((Institute of Genetics, 1977a (جدول 6) بينما لا يوجد ما يشير إلى أهمية الضوء في المرحلة الأولى من زراعة حبوب اللقاح ومتوك التبغ. ويفضل تعريض حبوب اللقاح والمتوك لفترة ظلام قصيرة جدا يتبعها ضوء مستمر لمدة 14 ساعة يوميا شدته 2000 لكس لتشجيع نمو النباتات من المتوك وزيادة عددها. بينما جاء في مضمون بعض الأبحاث على نباتات Hyoscyamus niger و Datura innoxia أن 16 ساعة ضوء فلوروسنت شدته 1500 لكس Lux وحرارة 28 م يعقبها 8 ساعات ظلام وحرارة 20م أعطت أفضل عدد من النباتات. كما أن زيادة تركيز ثاني أكسيد الكربون والإيثلين داخل أواني الزراعة يؤثر تأثيرا ضارا على نمو حبوب اللقاح وتكوين الأجنة. لذلك يضاف للبيئة ايدروكسيد بوتاسيوم لقدرته على امتصاص ثاني أكسيد الكربون ومركب Mercuric perchlo- rate لقدرته على امتصاص الإيثلين وإضافة 8-40 ملليجرام / لتر من 2-Chlo- roethyl - phosphonic acid (مادة منتجة للإيثلين) للبيئة تؤدى إلى تضاعف استجابة متوك الأرز Oryza sativa للنمو. ومضمون ذلك أن حبوب اللقاح والمتوك تختلف باختلاف نوع النبات في احتياجها من الظروف الهوائية والغازية لتحفيز نمو وتكوين الأجنة وتكشفها.
جدول (6) درجات الحرارة والمدة المناسبة لإنبات متوك بعض النجيليات
منشأ الأجنة الأحادية Haploid embryogenesis
1- أجنة ذكرية المنشأ والتكوين Androgenesis
هي أجنة أحادية العدد الكروموسومي تنشأ في المعمل من حبوب لقاح (جاميطات ذكرية) Microspores أو متوك بعد زراعتها في المعمل. وينتج عنها نباتات أحادية. وتختلف هذه النباتات وراثيا وظاهريا عن نبات الأم الذي فصل منه حبوب اللقاح والمتوك. وتنشأ الأجنة الأحادية بإحدى طريقتين :
(أ) منشأ أجنة ذكرية من حبوب اللقاح Pollen embryogenesis
- تكوين مباشر للأجنة الذكرية Direct embryogenesis حيث تنتج أجنة أحادية العدد الكروموسومى مباشرة من حبوب اللقاح بدون الدخول في مرحلة تكوين الكالس. وبعد 3 - 4 أسابيع تظهر الأجنة في صورة نموات أنبوبية تنمو وتتطور إلى نبتات أحادية العدد الكروموسومي .
- منشأ غير مباشر للأجنة Indirect embryogenesis حيث يتكون كالس أحادي العدد الكروموسومى من حبوب اللقاح. ثم يتكشف الكالس إلى أجنة أحادية ينتح عنه نباتات أحادية.
(ب) منشأ أجنة ذكرية من المتوك Anther embryogenesis
حيث ينتج عن زراعة المتوك نباتات مختلفة المستوى في التضاعف الكروموسومي. فالنباتات الناتجة من حبوب اللقاح تكون أحادية العدد الكروموسومي، والنباتات الناتجة من خلايا جدار المتك والخلايا الضامة تكون ثنائية العدد الكروموسومي لأنها خلايا جسمية وتختلف الفترة اللازمة لخروج النبتات من المتك باختلاف الأنواع النباتية. فتحتاج متوك الدخان من 3 إلى 5 أسابيع، وتحتاج متوك نبات الأتروبا والأرز 3 إلى 8 أسابيع. والمتوك المحتوية على حبوب لقاح وحيدة النواة Uninucleus والمزروعة على بيئة (MS) يتحول لونها إلى اللون البنى خلال أسبوعين بدون ظهور أي نمو. وبعد أسبوعين آخرين تظهر نموات أنبوبية هي عبارة عن أجنة مصدرها حبوب اللقاح في المتك، حيث تتطور بعد ذلك لتصبح نبتات أحادية العدد الكروموسومي Pollen embryogenesis. وقد يظهر عند الطرف القاعدي للمتك خلايا كالس تنمو حتى تغطى كل المتك وقد تنتج نبتات من الكالس ثنائية العدد الكروموسومى لأن مصدرها خلايا جسمية. وبعد 6 أسابيع تقريبا يمكن نقل النباتات إلى التربة.
2- أجنة أنثوية المنشأ والتكوين Genogenesis
هي أجنة أحادية العدد الكروموسومي تنشأ من بيضة غير مخصبة، وينتج عنها نبتات أحادية مختلفة وراثيا ومظهريا عن النبات الأم المفصول منه البيضة. وتنشأ هذه الأجنة الأحادية بإحدى طريقتين :
- نشوء الأجنة البكرية Parthenogenesis
قد تتكون نباتات أحادية تلقائيا بنسبة لا تزيد عن 0,01٪ بدون تدخل الإنسان. وهي من الحالات النادرة التي تحدث في بعض النباتات دون غيرها. ومصدر إنتاج الأجنة البكرية هو المبيض. فقد ينشط المبيض وينمو مكونا ثمرة تحتوي على بذور بدون اخصاب. وهذه البذور أحادية العدد الكروموسومي، وبزراعة هذه البذور في المعمل تنتج نباتات أحادية ضعيفة النمو صغيرة الحجم عقيمة وغير قادرة على الانقسام الاختزالي وتكوين خلايا تناسلية، لأنها تحتوى على كروموسومات غير متشابهة ولا تستطيع أن تكون أزواجا كروموسومية Bivalents، وهذه من خصائص المجموعة الكروموسومية الأحادية. وتتكون الأجنة الأحادية ذاتيا في الطبيعة من خلال التكوين البكري، أي بدون إخصاب، نتيجة لزيادة محتواها من هرمونات النمو وقد يحدث التلقيح وتنبت الأنبوبة اللقاحية من حبة اللقاح ولكنها تكون غير قادرة على استكمال نموها والنفاذ إلى المبيض وإتمام الإخصاب. ويكون دور حبوب اللقاح في هذه الحالة هو تنبيه المبيض فقط لإفراز هرمونات النمو.
- نشوء الأجنة من البيضة
هي أجنة تنشأ من البيضة غير المخصبة (الجاميطة المؤنثة) بعد فصلها وزراعتها في المعمل. وهي أجنة أحادية العدد الكروموسومى ينتج عنها نباتات أحادية لها نفس مواصفات الأجنة البكرية.
بعض الممارسات الوراثية لإنتاج أجنة أحادية
1- طريقة إقصاء الكروموسومات Chromosomes elimination
تستخدم هذه الطريقة لإنتاج أجنة شعير أحادية العدد الكروموسومى Haploid بكفاءة عالية. وتعتمد هذه الطريقة على إدخال نوع الشعير Hordeum bulbosum في تهجين مع النوع Hordeum vulgare لإنتاج هجين H.bulbosum x Hordeum vulgare. فتنمو أجنة الهجين لمدة 10 - 14 يوما من الإخصاب ثم تموت بعد اختفاء كروموسومات النوع H.bulbosum . فإذا فصلت أجنة الهجين مبكرا بعد 10 أيام من الإخصاب قبل موتها ثم زرعت على بيئة (B5) خالية من الأكسين D-2,4 فإنها تستمر في النمو وتكون نباتات معظمها أحادية العدد الكروموسومي (7 = n) Monoploid، تحتوي على كروموسومات النوع Hordeum vulgare فقط وبمعاملة النباتات بالكولشسين تنتج نباتات ثنائية متجانسة من النوع H. vulgare . وتحتوي الخلية الجسمية للشعير ثنائية العدد الكروموسومي Diploid على 14 كروموسوما (2n = 14). والجاميطة المذكرة والمؤنثة هي خلايا أحادية Haploid تحتوي على نصف عدد الكروموسومات (7=n). وباندماج الجاميطتين عن طريق التلقيح والإخصاب ينتج الهجين H. vulgare x H. bulbosum الذى تحتوى أجنته على 14 كروموسوما، أي أجنة ثنائية العدد الكروموسومي (2 = n 14) وخاصية إقصاء Elimination كروموسومات النوع H. bulosum بعد التهجين هي صفة وراثية بصرف النظر عن استخدامه كأب أو أم في التهجين أو إذا كان ثنائيا Diploid أو رباعيا Tetraploid.
كذلك تم الحصول على نباتات قمح أحادي بتهجين قمح سداسي Triticum aestivum (42= 6X = 2n) مع شعير ثنائي (14 = H. bulbosum (2n = 2X . وقد حدث إقصاء (تخلص ذاتي) لكروموسومات النوع H. bulbosum وتكونت أجنة أحادية من القمح n = 3X = 21 ) T.aestivum ). وقد تميزت هذه الطريقة عن طريقة زراعة المتوك في إنتاج نباتات أحادية العدد الكروموسومى من أي صنف تجارى من الشعير ومعدل إنتاج النباتات الأحادية مرتفع جدا. كذلك يمكن الاستفادة من هذه الطريقة في إنتاج نباتات أحادية متضاعفة Dihaploids من نباتات البطاطس Solanum tuberosum الرباعية Tetraploids بواسطة تهجين النوع Solanum tuberosum بحبوب لقاح من النوع S.phureja الثنائي.
2- زراعة الإندوسبرم Endosperm culture
تم الحصول على كالس وأجنة ونبتات ثلاثية التضاعف الكروموسومي Triploids بزراعة نواة الإندوسبرم المفصولة من الكيس الجنيني للموالح (27 = n3) بعد حوالي شهرين من الإخصاب. وقد تحقق ذلك بزراعة الاندوسبرم المفصول من الموالح .Citrus grandis L.Osbeck صنف Bei Pei Pummels والنوع C. sinensis Osbeck صنف Chin-Cheng or Osbeck على بيئة غذائية (2MT) مضافا إليها (GA3) بتركيز 5,77 - 43,3 ميكرومولر.
العوامل المؤثرة في تكوين الأجنة الذكرية
Androgenesis
تنتج أجنة ذكرية في المعمل بزراعة متوك بعض الأنواع النباتية التابعة للعائلة الباذنجانية Solanaceae والنجيلية Gramineae والصليبية Cruciferae. والعوامل المؤثرة في إنتاج الأجنة الذكرية منها :
1- عمر النبات
يؤثر عمر النبات والمرحلة الفسيولوجية تأثيرا واضحا على تكوين الأجنة الذكرية. فالأزهار المفصولة من نباتات حديثة العمر نسبيا وفى بداية موسم التزهير تكون مناسبة لإنتاج أجنة ذكرية أكثر من البراعم الزهرية المفصولة من نباتات متقدمة في العمر أو في نهاية موسم التزهير.
2- مرحلة نمو حبوب اللقاح
مرحلة نمو حبوب اللقاح من العوامل الهامة المؤثرة في إنتاج أجنة ذكرية. فزراعة متوك التبغ والداتورا والهيوسيامس Hyoscyamus وهي في مرحلة تكون فيها حبوب اللقاح أحادية النواة Uninucleate تنتج نباتات أحادية العدد الكروموسومي فقط . بينما زراعة حبوب لقاح متقدمة في العمر تعطى نباتات متعددة في مستوى التضاعف الكروموسومى، وكانت أفضل النتائج بالنسبة لنباتات التبغ والطماطم عندما كانت حبوب اللقاح في مرحلة ثنائي النواة Binucleate.
3- الصدمات الحرارية Thermal shocks
الصدمات الحرارية المرتفعة أو المنخفضة أو المتبادلة مع بعضهما تظهر نجاحا في تكوين الأجنة الأحادية في مزارع المتوك وحبوب اللقاح، وقد تحقق ذلك في نباتات الداتورا والطماطم والأتروبا والتبغ والمعاملة الباردة التي يعقبها فترة قصيرة حرارة مرتفعة تؤدى إلى انقسام متكرر لحبة اللقاح، وتعريض متوك نبات الكرنب Brassica لحرارة 30 م لمدة 24 ساعة أو 40 م لمدة ساعة واحدة كان له تأثير منشط لتكوين الأجنة الذكرية (1981 .Keller, et al). وقد فسر ذلك بأن المعاملة الباردة لها تأثير غير مباشر في زيادة عدد الأجنة الذكرية، والحرارة المنخفضة 3 - 5 م تحافظ على حيوية حبوب اللقاح مدة طويلة وتؤخر شيخوختها وتمنع اجهاضها. ويزداد بذلك عدد حبوب اللقاح القادرة على تكوين أجنة ذكرية (1978 Bajaj,). بينما الصدمات الحرارية تؤدى إلى تحلل الأنابيب الدقيقة Microtubules وتشتت خيوط المغزل من مكانها وتسبب انقسامات شاذة لنواة حبة اللقاح.
4- الفحم النباتي Active charcoal
إضافة الفحم النباتي بنسبة 2 ٪ إلى البيئة المزروعة بمتوك نبات التبغ يؤدى إلى زيادة عدد الأجنة الذكرية من 15% إلى 45% للصنف هافانا Havana، ومن 41 % إلى 91% للصنف Badischer Burley. ويؤدى إلى زيادة عدد النباتات وسرعة نموها، ويؤدى أيضا إلى زيادة عدد الأجنة الذكرية للأنيمون Anemone والشوفان Rye والبطاطس. وينشط تكوين الأجنة الذكرية لنبات الجزر في حالة غياب الأكسين من البيئة وإضافة الأكسين للبيئة ينشط تكوين الأجنة الذكرية لنبات التبغ في حالة غياب الفحم النباتي. وترجع أهمية الفحم النباتي في تنشيط وإنتاج الأجنة الذكرية لبعض الأنواع النباتية إلى قدرته على امتصاص مركب Hydroxymethyl furfural-5 الناتج من السكروز أثناء تعقيم البيئة بالأوتوكلاف وغيره من المركبات السامة التي تسبب موت الأجنة الذكرية النامية من حبوب اللقاح. كما أن الفحم النباتي يقوم بتنظيم امتصاص منظمات النمو الداخلية Endogenous والخارجية Exogenous.
طرق الحصول على أجنة أحادية من البيضة
1- زراعة بويضات غير مخصبة في المعمل
هي وسيلة لإنتاج نباتات أحادية تحمل صفات الأم. ويتم ذلك بزراعة البيضة غير المخصبة. وقد أمكن إنتاج نباتات أحادية من نبات Aerva tomentosa بزراعة البراعم الزهرية أو السنابل غير المخصبة.
2- تنبيه المبيض باستخدام حبوب لقاح غير مكتملة الحيوية
ينشط المبيض باستخدام حبوب لقاح غير كاملة الحيوية أو من أنواع بعيدة القرابة وتعريض حبوب اللقاح لجرعات مناسبة من أشعة جاما أو الأشعة السينية يؤدى إلى خفض حيويتها بحيث يكون لها القدرة على الإنبات واختراق الميسم والقلم لمسافة محدودة ثم تموت قبل الوصول إلى الكيس الجنيني، وهذه المعاملة تعمل على تنبيه المبيض للنمو وتكوين أجنة أحادية تحمل نصف عدد كروموسومات الأم. فإذا زرعت الأجنة مبكرا في المعمل تنتج نباتات أحادية عقيمة لا تنتج بذورا إلا إذا تحولت إلى نباتات ثنائية بالكولشسين.
3- تنبيه البيضة بالصدمة الحرارية Thermal shock
قد تؤدى المعاملة الحرارية المفاجئة إلى تنبيه المبيض للنمو وتكوين أجنة بكرية بدون إخصاب. وبزراعة هذه الأجنة تنتج نباتات أحادية. وقد تحقق ذلك بتعريض نباتات الداتورا Datura stramonium إلى حرارة منخفضة أثناء الإخصاب، وتعريض نباتات التبغ إلى حرارة منخفضة أو مرتفعة، وتعريض نباتات الشوفان Rye إلى 3 م. وفى جميع هذه الحالات تكون النباتات الناتجة في المعمل أحادية عقيمة ناتجة أصلا من البيضة وتحتوي على كروموسومات البيضة فقط. ولإنجاح هذه التجربة يجب تعريض كل من البيضة وحبة اللقاح إلى نفس الصدمة الحرارية. وتسبب الصدمات الحرارية المفاجئة إلى تغيير نظام انقسام نواة حبة اللقاح والبيضة. فقد وجد أن معاملة حبوب لقاح نبات Hyoscyamus orientalis بالبرودة فقط تفقدها القدرة على الإخصاب.
4- تنبيه البيضة بالمعاملة الكيميائية Chemical treatment
تحدث بعض الكيماويات ظاهرة الأجنة البكرية Parthenogenesis ، فلوحظ نشاط البيضة داخل الكيس الجنيني وانقسامها عدة انقسامات متتالية بعد حقن مبيض نبات البيتونيا بمركب بلفيتان Belvitan ، أو رش النباتات ببعض منظمات النمو مثل الإيثريل Ethrel التي تسبب عقما ذكريا ويبقى المبيض حيا ليكون ثمرة.
الإخصاب المعملي In vitro fertilization
يواجه مربو النبات بعض الظواهر مثل عدم التوافق الذاتي Self- incompatibility وعدم التوافق الخلطي Cross-incompatibility. ويعني ذلك عدم إنبات حبة اللقاح على الميسم وعدم حدوث إخصاب، وقد تنبت حبة اللقاح وتخرج منها أنبوبة لقاحية ولكنها لا تستطيع استكمال مسارها داخل القلم وتتوقف قبل الوصول إلى المبيض ولا يكتمل الإخصاب. وقد يحدث إخصاب لخلية البيضة ويتكون الجنين ولكنه يتوقف عن النمو ويموت مبكرا. ومضمون ذلك أن عدم التوافق يؤدى إلى عدم تكوين البذور. ولم تظهر فكرة الإخصاب المعملي داخل أنبوبة اختبار قبل 1962. وفى الواقع أن المعلومات حول الإخصاب المعملي مازالت محدودة.
طرق الإخصاب المعملي
1- إخصاب الميسم Stigma fertilization
في هذه الطريقة تعقم الزهرة الخنثى تعقيما جيدا مع الحرص بعدم ملامسة الميسم لمادة التعقيم لفترة طويلة حتى لا يؤدى إلى إزالة المادة اللزجة وعدم التصاق حبوب اللقاح على الميسم. ويزرع المبيض المعقم على بيئة غذائية صلبة في أنبوبة اختبار، ثم تنثر حبوب اللقاح من المتك على الميسم. وهذه الطريقة مماثلة للإخصاب الذي يتم في الحقل. ويمكن استخدامها إذا كان المبيض يسقط مبكرا قبل النضج. ويعتبر إخصاب الميسم أفضل من إخصاب المشيمة لنبات التبغ وتستخدم هذه الطريقة بنجاح مع الأنواع:
Antirrhinum majus; Pisum sativum; Lathyrus odoratus; Zea mays; Glycine max; Nicotiana rustica; Nicotiana tabacum; Petunia violacea.
2- إخصاب المشيمة Placental fertilization
تفصل مشيمة محتوية على بويضات غير مخصبة من زهرة معقمة جيدا ويتم ذلك تحت ستريوميكروسكوب ثم تزرع في بيئة غذائية. وتعقم المتوك وهي في مرحلة ما قبل الانفتاح مباشرة. وتستخدم المتوك التي تنفتح أثناء التعقيم، وينثر منها حبوب اللقاح قريبا من البويضات غير المخصبة. وينتظر حتى تنبت حبوب اللقاح وتخترق الكيس الجنيني Embryo-sac. وقد نجحت هذه الطريقة مع نباتات العائلة Caryo phyllaceae والأنواع النباتية التابعة لجنس القطن Gossypium والذرة Zea mays .
عوامل إنجاح الإخصاب المعملي
- أن تكون حبوب اللقاح والبويضات في حالة فسيولوجية وتكوينية سليمة.
- يجب أن تتغير مكونات البيئة الغذائية بتغيير مرحلة النمو ابتداء من إنبات حبوب اللقاح والإخصاب ونمو الجنين، وقد يضاف إليها بعض المعقدات الطبيعية المناسبة لكل مرحلة.
- درجة حرارة التحضين قد تكون عاملا هاما لإنجاح عملية الإخصاب، فمثلا يحتاج البنفسج Narcissus إلى التحضين عند أقل من 25 م ويحتاج الخشخاش Papaver somniferum للتحضين عند أكثر من 25 م.
- ينجح إخصاب المشيمة أحيانا إذا كانت النباتات تحتوي بصورة طبيعية على ظاهرة عدم التوافق الذاتي. ومن أمثلة ذلك التهجين بين نباتات نوعين من البيتونيا : Petunia hybridsg Petunia axillaris .
- ينجح التلقيح الخلطي أحيانا حتى ولو كان غير ناجح في الحقل. وقد تم إنتاج نباتات هجن من نبات التبغ نوع Nicotiana alata بعد إخصاب البويضات في أنبوبة اختبار بحبوب لقاح من نبات التبغ نوع Nicotiana tabacum.
طرق مضاعفة العدد الكروموسومى
1- تضاعف العدد الكروموسومى بدون انقسام النواة Endomitosis
الخلايا الأحادية Haploids هي خلايا غير مستقرة أثناء الزراعة المعملية، وتميل دائما إلى مضاعفة العدد الكروموسومى ذاتيا بدون انقسام للنواة، فيتضاعف عدد الكروموسومات داخل النواة وتصبح خلية ثنائية.
2- المعاملة بالكولشسين Cholchicine treatment
يستخدم الكولشسين على نطاق واسع كمانع لتكوين خيوط المغزل Spindle والصفيحة الوسطى Middle lamella بالخلية، فيتضاعف عدد الكروسومات بها وتصبح خلية واحدة متضاعفة ينتج عنها نبات متضاعف Polyploid. وقد تم الاستفادة من هذا المركب للحصول على سلالات ثنائية متجانسة Homozygous lines من خلال الزراعة المعملية لخلايا أو أنسجة أحادية العدد الكروموسومي. ويتم ذلك بزراعة المتوك ومعاملة النبتات الأحادية الناتجة - وهي مازالت متزاحمة ومحاطة بجدار المتك - بمادة الكولشسين بتركيز 0٫5٪ ولمدة 24 - 48 ساعة ثم تغسل جيدا بعد إخراجها من المتك ثم يعاد زراعتها معمليا بعد فصلها عن بعضها. كذلك يمكن معاملة النباتات الناضجة بعجينة من اللانولين Lanolin تحتوي على 0,4 % كولشسين وتضاف إلى إبط الأوراق. وعند الحصول على نباتات ثنائية خصبة متجانسة يمكن استخدامها كسلالات نقية Inbred lines تدخل بعد ذلك في إنتاج الهجن.
الاكثر قراءة في الزراعة النسيجية
اخر الاخبار
اخبار العتبة العباسية المقدسة
