الكائنات دون الفايروسية

هي الكائنات الأصغر حجما وتركيبا من الفايروسات ولكنها تماثلها تركيبيا كونها تتكون من أحماض نووية عارية أو مغلفة بغطاء بروتيني وتشمل هذه الكائنات:

الفايروسات التابعة Satellite viruses والتوابع الرايبية Satellite RNAs والفايرويدات Viroids.

الفايرويدات Viroids

هي كائنات رايبية حلقية أحادية الخيط RNAs مستقلة عارية بدون غطاء بروتيني وهي متطفلات نباتية وتعد أصغر الكائنات الممرضة للنبات، (الشكل 1) ولم يسجل تطفلها على أي مجموعة من الكائنات الحية باستثناء النباتات الراقية واكتشفت لأول مرة من قبل Diener  (1971) عند دراسته لمرض الدرنة المغزلية للبطاطا ويصل حجم جينومها إلى عدة مئات من النيوكليوتايدات مع وجود تركيب ثانوي عالي التنظيم، والجينوم الفايرويدي قادر على التضاعف بشكل مستقل ولكنه لا يشفر أية بروتينات، والفايرويدات ممرضات نباتية مهمة بسبب ما تحدثه من أمراض نباتية مؤثرة على الإنتاج النباتي وخصوصا في أشجار الفاكهة والبطاطا، وأكثر الفايرويدات دراسة هو فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا Potato spindle tuber viroid , PSTVd.

الشكل (1): صورة بالمجهر الالكتروني للجينومات الحلقية لفايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا، ويلاحظ انفتاح بعضها لتصبح بشكل خيطي نتيجة تحضير العينة للفحص. الشكل مقتبس منAgrios  (2005).

1. تصنيف وتسمية الفايرويدات

صنفت الفايرويدات كمجموعة مستقلة من الكائنات لا علاقة لها بالفايروسات وقد وضعت كل الأجناس والأنواع الفايرويدية المسجلة في عائلتين هما: Pospiviroidae وAvsunviroidae، (الجدول ادناه) وقد تمت المصادقة على هذا التصنيف من قبل اللجنة الدولية لتصنيف الفايروسات ICTV والذي صدر في تقريرها السابع ولكن سجلت فايرويدات أخرى محتملة لم يتم ادراجها في الجدول وهي (1) فايرويد تجعد ثمار التفاح Apple fruit crinkle viroid (2) فايرويد تقزم الارقطيون Burdock stunt viroid (3) فايرويد الباذنجان الكامن Eggplant latent viroid (4) فايرويد تقزم التبغ البريNicotiana glutinosa stunt viroid  (5) فايرويد الموزائيك التبرقشي للبزاليا الهندية Pigeon pea mosaic mottle Viroid (6) فايرويد تجعد قمة الطماطة Tomato bunchy top viroid ولم تصنف هذه الفايرويدات إلى الأجناس المذكورة لعدم معرفة تعاقد النيوكليوتايدي لحد الأن.

أما تسمية الفايرويدات فقد تمت بالطريقة ذاتها المستعملة مع الفايروسات أي استعمال الاسم الانكليزي الشائع واعتباره الاسم العلمي مع استعمال الاسم المختصر المكون من الأحرف الأولى الاستهلالية لأسم الفايرويد مع إضافة الحرف d في نهاية الاسم المختصر للدلالة على الفايرويد وتمييزا له عن الفايروس مثال ذلك فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا Potato spindle tuber viroid ومختصره PSTVd.

جدول يوضح انواع الفايرويدات المسجلة وتصنيفها وحجم جينوماتها

2. التأثيرات الإمراضية للفايرويدات

تصيب الفايرويدات النباتات الراقية مغطاة البذور ومن ذوات الفلقة الواحدة والفلقتين ولم تسجل على أنواع نباتية أخرى لحد الآن وهي تسبب أعراضا تماثل الأعراض الفايروسية وتشمل التقزم والتبرقش والتشوهات، (الشكل 2) ونادرا ما تسبب موت النسيج ومنها فايرويد كادانا جوز الهند (CCCVd) الذي يسبب مرضا مميتا لأشجار جوز الهند، وعلى النقيض من ذلك تسبب بعض الفايرويدات أمراضا بلا أعراض كما هو الحال مع فايرويد الكامن للخشخاش (HLVd).

الشكل (2): أعراض منوعة تسببها بعض أنواع الفايرويدات على عوائلها النباتية.

(ا) و (ب) اعراض فايرويد سفعة الشمس لنبات الافوكادو على ثمار الافوكادو (ج) اوراق الداوودي المصابة بثلاثة أنواع من الفايرويدات، من اليمين: أعراض فايرويد التبرقش الأصفر لداوودي، فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا، أعراض تقزم الداوودي والورقة الأخيرة سليمة (د) و(ه) أعراض تشقق وندب على ثمار التفاح المصابة بفايرويد الجلد الندبي للتفاح.

الشكل مقتبس من Mahy و Van Regenmortel (2008).

تسبب الفايرويدات أعراضا داخلية متنوعة في عوائلها النباتية ومنها إحداث تغيرات

شكلية في التراكيب الغشائية الخلوية والتي يطلق عليها Plasmalemmasomes وتسبب أيضا زيادات غير منتظمة في سمك الجدر الخلوية المصابة وتحطيم للكلوروبلاستات، ولوحظ وجود جسيمات فايرويدي كادانك جوز الهند (CCCVd) وأكسوكورتس الحمضيات (CEVd) في الأنسجة الوعائية وخلايا الميزوفيل لأنسجة عوائلها وبات مؤكدا الآن أن معظم الفايرويدات توجد في نوى الخلايا المصابة ولكن وجدت عدد من الفايرويدات في مواقع أخرى خلوية فقد وجد فايرويد سفعة الشمس نبات الأفوكادو (ASBVd) في الكلور وبلاستات ووجد فايرويدي الدرنة المغزلية للبطاطا (PSTVd) وكادانك جوز الهند (CCCVd) في نويات الخلايا فيما وجد فايرويد أكسوكورتس الحمضيات (CEVd) في منطقة النيوكليوبلازم Nucleoplasm.

بينت الدراسات التحليلية لمكونات النباتات المصابة أن الفايرويدات لا تسبب تغيرات في أيض الأحماض النووية ولكن لوحظ حصول زيادة في كميات بروتينات العائل وخصوصا البروتينات المرتبطة بالإمراضية.

3. حركة الفايرويدات في النباتات

لا تعرف الألية التي تتحرك بها الفايرويدات عبر الخلايا المصابة أي ما يعرف بالحركة البطيئة، أما حركتها السريعة فتتم في أوعية اللحاء وبذات آلية نقل الفايروسات بهذه الأوعية ويبدوا أن المقاومة التي تبديها الفايرويدات ضد إنزيم النيوكلييز هي التي تسهل حركتها في أوعية اللحاء ويعتقد أنها تشفر بروتينات حركة ترتبط بجينوماتها لتسهيل حركتها في النبات.

4. طرق نقل الفايرويدات

تنقل الفايرويدات ميكانيكيا بسهولة إلى معظم عوائلها النباتية ويتم ذلك بواسطة تلوث الأدوات الزراعية والملاحظ أن هذا النقل يحصل بكفاءة رغم وجود إنزيم النيوكلييز النباتي والذي يكون شديد التأثير عليها ولكنها تتجنب تأثيره المتلف للأحماض النووية بسبب امتلاك جينوماتها للتركيب الثانوي الجينومي الذي يمنحها مقاومة لتأثير الإنزيم كما أن لديها الية أخرى لذات الغرض وهي ارتباطها المعقد مع أنواع من البروتينات النباتية عند حركتها في النبات مما يحميها من تأثير هذا الإنزيم غير المؤثر على البروتينات. سجل نقل فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا (PSTVd) بحبوب لقاح البطاطا وبذورها إلا أن هذه الطريقة لا تلعب دورا في نقل هذا الفايرويد في الحقول لأن طريقة الإكثار المتبعة لهذا النبات هي بواسطة الدرنات، كما سجل أيضا نقل فايرويدات الطماطة والعنب ببذور وحبوب لقاح هذين النباتين، وسجل نقل فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا بنوع المن Macrosiphum euphorbae وبالطريقة غير الباقية وأن كفاءة النقل وصلت إلى 100% عندما كانت النباتات مصدر الفايرويد مصابة أيضا بفايروس التفاف أوراق البطاطا (PLRV). تنقل الفايرويدات أيضا بطرق الإكثار الخضري وهي الطريقة المسئولة عن النشر الوبائي للعديد من الفايرويدات وخاصة فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا (PSTVd) في محصول البطاطا وفايرويد تقزم الداوودي (CSVd) في نباتات الداوودي، فيما يعد النقل الميكانيكي الوسيلة الأساسية للنشر الوبائي لفايرويد أكسوكرتس الحمضيات (CEVd) في أشجار الحمضيات وفايرويد تقزم الخشخاش (HSVd) في نباتات الخشخاش، أما النشر الوبائي لفايرويد لفايرويد سفعة الشمس لنبات الأفوكادو (ASBVd) في محصول الأفوكادو فيتم بحبوب اللقاح.

5. تركيب الفايرويدات

تمتاز الجينومات الفايرويدية بشكلها الحلقي الدائري أو الحلقي المتطاول ومثال ذلك فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا (PSTVd) والمبين طبيعة جينومه في الشكل (1) والذي يصل طوله إلى 37 نانومتر، كما تمت دراسة التعاقب النيوكليوتايدي للجينومات المسجلة وعرفت حجوم جينوماتها. تمتلك معظم الفايرويدات نسبة عالية من قاعدتي الكوانين والسايتوسين تصل إلى 60% من مجمل القواعد المكونة للجينوم فيما لوحظ زيادة نسبة قاعدتي اليوراسيل والأدينين (62%) في فايرويد سفعة الشمس النبات الأفوكادو (ASBVd)، وتكون الفايرويدات تركيبا ثانويا للجينوم والمتمثل بازدواج والتفاف الحامض النووي مكونا الشكل الحلقي والعروات Loops التي يطلق عليها "مناطق رأس المطرقة" Hummerhead regions حيث يعمل هذا التركيب على زيادة أعداد أزواج القواعد إلى الحد الأعلى الممكن، (الشكل 3) وجاء تصنيف الفايرويدات إلى عائلتين على هذا الأساس حيث أن أفراد عائلة Pospiviridae هي ذات جينومات حلقية متطاولة عصوية مزدوجة وفيها مناطق عروات "المناطق رأس المطرقة" غير المزدوجة، فيما تكون جينومات عائلة Avsunviroidae أقل تعقيدا، وتحتوي الجينومات الفايرويدية عموما على مناطق وظيفية عديدة يبينها الشكل (3).

الشكل (3): جينوم فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا حيث يظهر التركيب الثانوي للجينوم المكون من 359 نيوكليوتايدة مرتبة بطريقة ازدواجية كثيفة تعطي الثباتية المطلوبة للجينوم، يلاحظ أن المنطقتين الطرفيتين اليمنى واليسرى هما المسئولتين عن تضاعف الفايرويد، أما منطقة الإمراضية فتضم الجين المسئول عن إحداث الإصابة، ويحافظ الجينوم على ثباتيته من خلال المنطقة المحافظة، أما المنطقة المتغيرة فهي أقل ثباتا، كما تبين العروات البيضوية مواقع عدم الازدواج في الجينوم والتي يطلق عليها "مناطق رأس المطرقة" Hummerhead regions. الشكل مقتبس من Agrios ((2005.

6. تضاعف الفايرويدات

يعتقد أن أفراد عائلة Pospiviridae تتضاعف في نوى خلايا عوائلها كونها تتطفل فيها أما أفراد عائلة Avsunviroidae فهي مرتبطة بالكلوروبلاستات لذلك يعتقد أنها تتضاعف فيها ودليل ذلك الكشف عن وجود الشكل التضاعفي والمكون من ازدواج الخيط السالب والموجب الفايرويد الموزائيك الكامن للخوخ (PLMVd) فيها وهو الشكل الذي يمثل مرحلة مهمة من مراحل التضاعف الفايرويدي في خلايا العائل وأن إنزيم بوليميريز الكلوروبلاست Chloroplast polymerase يلعب دورا في تضاعفها، وحيث أن الفايرويدات لا تشفر بروتيناتها وبضمنها إنزيمات تضاعفها لذا يتوقع استعمالها للإنزيمات الخلوية التي تستعملها الخلايا في تضاعف أحماضها النووية حيث تحتاج الفايرويدات إلى ثلاثة أنظمة إنزيمية لتضاعفها وهي (1) إنزيم التضاعف الرايبي RNA polymerase (2) إنزيم لشطر العديدات الخيطية linear multimeric Strands الناتجة من التضاعف الحلقي الالتفافي وهو إنزيم RNase (3) إنزيم الربط RNA ligase لتكوين الموحودات الحلقية Circular TOOT8S.

نشرت العديد من الدراسات لتفسير آليات تضاعف الفايرويدات وتوصلت إلى أن التضاعف يتم بالطريقة الحلقية الالتفافية (Rolling Circle method) والمبينة في الشكل (4) بنموذجيها المقترحين حيث تستنسخ الموحودات الحلقية المغلقة الأبوية Closed Circular monomers بتكوين القالب الرايبي RNA template لإنتاج جزيئات رايبية خيطية طويلة تسمى "العديدات الخيطية الطويلة" Long linear multimeric strands إن الالية الدقيقة لطريقة التضاعف لم تتوضح تماما لذلك وضع هذين النمو ذجين للطريقة الحلقية الالتفافية.

الشكل (4): اليتي التضاعف المقترحة للفايرويدات بالطريقة الحلقية الالتفافية Rolling circle method.

(أ) الية التضاعف بالمسار التناظري Symmetric pathway: يتم التضاعف في هذا المسار بدورتين من الآلية الحلقية الالتفافية ووفق الخطوات التالية (1) تبدأ الدورة الأولى بتضاعف الجينوم الأبوي المزدوج الحلقي الموجب وتكوين الخيط المزدوج المفتوح السالب (القالب) والذي يحمل مواقع الانشطار والمسماة "رايبوزايمات رأس المطرقة" Hammerhead fibozymes ومختصرها RZ، حيث يمثل الخيطان السالب والموجب الشكل التضاعفي المسمى "الخيط المتعدد" Multimeric Strand (2) ينشطر الخيط السالب المفتوح (القالب) في موقعي الشطر المبينين ليعطي القطعة الرايبية الموحودة Linear monomeric RNA التي ستكون الفرد الجديد، ثم تتكون قطعة أخرى بانشطار جديد للخيط السالب وهكذا (3) تلتف القطعة الرايبية السالبة لتصبح حلقية (4) تبدأ الدورة الثانية بتضاعف القطعة الحلقية السالبة لتكوين الخيط الموجب المفتوح والذي يحمل مواقع الانشطار رايبوزايمات رأس المطرقة" RZ (5) ينشطر الخيط الموجب المفتوح الجديد في موقعي الشطر ليعطي القطعة الرايبية الموحودة الموجبة المفتوحة Linear monomeric RNA التي ستكون الفرد الجديد (6) التفاف الخيط الموجب المفتوح الجديد ليكون الجينوم الجديد (يطلق عليه الموحود الحلقي Circular monomer) والذي عاد مشابها للجينوم الأبوي.

(ب) آلية التضاعف بالمسار اللاتناظري Asymmetric pathway: يتم التضاعف في هذا المسار بدورة واحدة من الآلية الحلقية الالتفافية ووفق الخطوات التالية (1) تبدأ الدورة الأولى بتضاعف الجينوم الأبوي المزدوج الحلقي الموجب وتكوين الخيط المزدوج المفتوح السالب (القالب) حيث يمثل الخيطان السالب والموجب، الشكل التضاعفي المسمى "الخيط المتعدد" Multimeric Strand (2) تكوين الخيط المزدوج السالب المفتوح (القالب) الموحود Linear monomeric RNA الذي سيكون الفرد الجديد (3) يعمل الخيط المزدوج السالب المفتوح بمثابة قالب لإنتاج خيوط مزدوجة جديدة والتي تحمل مواقع الانشطار رايبوزايمات رأس المطرقة" RZ حيث تنشطر عندها القطع الرايبية الموحودة التي ستكون الفرد الجديد، ويستمر القالب بإنتاج الخيوط المزدوجة تباعا (4) القطعة الرايبية الموحودة الموجبة المفتوحة والتي سيتم إنتاج العديد منها (5) التفاف القطع الرايبية الموحودة المفتوحة الجديدة لتكون الجينوم الجديد والذي عاد مشابها للجينوم الأبوي.

الشكل مقتبس من Hull (2002).

7. طرق تشخيص الفايرويدات

لا تستعمل الطرق المصلية لتشخيص الفايرويدات وذلك لعدم قدرتها على تشفير أي نوع من البروتينات التركيبية أو الوظيفية اللازمة لإنتاج المصول المضادة كذلك وبسبب عدم امتلاكها لخصائص واضحة مظهرية لجسيماتها لذا فإن تقانات المجهر الالكتروني لا تعد مناسبة لتشخيصها عليه فقد انحصرت طرق تشخيصها بالطرق التالية:

1) التشخيص باستعمال النباتات الكاشفة

تعد الطريقة الأفضل للكشف عن الفايرويدات وتشخيصها وذلك لسهولة نقلها ميكانيكيا.

2) التشخيص بالترحيل الكهربائي الهلامي

تستعمل طريقة الترحيل الكهربائي الهلامي electrophoresis Gel التي تدمج بين الفصل بالترحيل الكهربائي والترشيح الهلامي لتشخيص الفايرويدات وأكثر الهلامات استعمالا هو البولي أكريل أمايد وحيث أن الفايرويدات توجد بتراكيز منخفضة عادة في عوائلها لذا يفضل إجراء تنقية جزئية لها لتركيزها قبل تمريرها في الهلام وقد استعملت هذه الطريقة للكشف عن فايرويد الدرنة المغزلية للبطاطا (PSTVd) في بذور البطاطا.

3) التشخيص بتهجين الحامض النووي

استعملت طريقة تهجين الحامض النووي Nucleic acid hybridization لتشخيص الفايرويدات وهي ذات الطريقة المستعملة مع الفايروسات، حيث يتم إعداد نسخ من دنا cDNA للفايرويد مع استعمال المجسات Probes والتي أصبحت تستعمل لتشخيص العديد من الفايرويدات حيث تتوفر الأن "مجسات قليلة النيوكليوتايدات" Oligonucleotide probes لفايرويدات الدرنة المغزلية للبطاطا (PSTVd) وتقزم الخشخاش (HSVd) وأكسوكورتس الحمضيات (CEVd). كذلك استعملت طريقة التهجين بالبصمة البقعية Dot blot hybridization وطريقة التهجين ببصمة النسيج النباتيTissue print hybridization للكشف عن العديد من الفايرويدات.

4) التشخيص بالتفاعل المتسلسل للبوليميريز بالاستنساخ العكسي

استعملت هذه التقانة المعروفة اختصارا RT-PCR لتشخيص الفايرويدات بتضخيم الحامض الرايبي للفايرويد بتحويله أولا إلى الدنا ثم يخضع لإجراءات PCR المعتادة وقد استعملت بنجاح لتشخيص فايرويدات سفعة الشمس لنبات الأفوكادو (ASBVd) والجلد الندبي للتفاح (ASSVd) ووأكسوكورتس الحمضيات (CEVd).