تشخيص فايروسات النبات بالمجهر الالكتروني

1. نوعي المجهر الالكتروني وآلية عملهما

يعد المجهر الالكتروني  Transmission electron microscope, TEM اداة ممتازة لمعرفة أشكال وأبعاد فايروسات النبات والاستفادة من هذه الصفات في تشخيص الفايروسات إلا أن كفاءة المجهر ازدادت كثيرا عند تطوير تقانات الإجهارية الالكترونية التخصصية والتي سنتحدث عنها لاحقا والتي دمجت بين المجهر الالكتروني والطرق المصلية، يعمل المجهر الالكتروني النافذ، (الشكل 1) بتعريض العينة المراد رؤيتها إلى سيل من الالكترونات تنطلق بسرعة الضوء عندما تنبعث من سلك معدن التنكستن Tungsten filament بعد تعريضه إلى فولتية كهربية عالية جدا فتنطلق الالكترونات داخل أنبوبة المجهر المسماة "مدفع الالكترونات" المفرغة الهواء والتي ينظم سيرها أقطاب مغناطيسية Electromagnatic lenses باتجاه العينة والتي ستتم رؤيتها بسبب حيود الأشعة الالكترونية عنها وعدم اختراقها بعد صبغها بصبغة تحوي معدن ثقيل فيتكون ظل الجسم وهي الصورة التي ترى على شاشة المجهر، لا تتمكن الأشعة الالكترونية من اختراق عينة يزيد سمكها عن 200 نانوميتر كذلك لا يمكن فحص العينات الطازجة مباشرة بالمجهر وذلك لأن سيل الالكترونات يسبب تبخرا سريعا للماء منها ويسبب تطايره السريع داخل أنبوبة المجهر استحالة الرؤية وإن سبب تفريغ الهواء من أنبوبة المجهر هو منع تكاثف جزيئات الغازات الهيدروكربونية أثناء مرور الالكترونات فيها وتحولها إلى جزيئات كربون بأطوال تصل إلى 10 أنكستروم تترسب على العينة فتعيق الرؤيا وإذا حصل مثل هذا التلوث الغازي فانه يعالج باستعمال أسلاك معدنية خاصة تبرد بالنتروجين المسال لغاية 195م تحت الصفر المئوي فتتكاثف عليها الغازات ثم تسحب من أنبوبة المجهر.

يمتلك المجهر الالكتروني "قوة توضيح" Resolution عالية جدا ويقصد بقوة التوضيح هي إمكانية التمييز بين أقرب نقطتين منفصلتين أو أنها أقل مسافة يمكن تمييزها بين نقطتين فمثلا قوة توضيح العين البشرية السليمة هي 0,1 ملم على بعد 25 سم أي أنها قادرة على تمييز نقطتين بوضوح بينهما المسافة 0,1 ملم من البعد المذكور وتصل قوة توضيح احدث المجاهر الالكترونية إلى نانومتر واحد وهذا يعني أن قوة تكبيرها العليا تصل إلى مليون مرة.

النوع الثاني من المجاهر الالكترونية هو المجهر الالكتروني الماسح Scanning -EM المعروف اختصارا SEM وهو أقل استعمالا في الدراسات الفايروسية وأقل قوة تكبير من المجهر النافذ ويستعمل لدراسة الشكل الظاهري للجسيمات الفايروسية ليعطي صورا واقعية ثلاثية الأبعاد، كما تختلف تقانات إعداد العينة للفحص به عن تلك المستعملة مع المجهر الالكتروني النافذ والتي تتم بتغليف العينة ببخار الكربون أو الذهب لغرض تظليلها باستعمال جهاز التغطية المفرغ الهواء High Vacuum Coating unit والذي يعمل بتيار كهربائي عالي الفولتية (20 كيلوفولت) فتتناثر جزيئات المعدن وتتوزع بانتظام على سطح العينة وتغلفها فلا تخترقها الالكترونات.

الشكل (1): المجهر الالكتروني النافذ حيث تلاحظ أنبوبة المجهر (مدفع الالكترونات) البيضاء اللون وفي نهايتها السفلى توجد شاشة العرض.

الشكل مقتبس من Carter و Saunder ((2007.

2. الصبغات المستعملة في دراسات المجهر الالكتروني

إن صبغ الجسيمات الفايروسية والأجسام الأخرى المراد فحصها بالمجهر الالكتروني لا يماثل الصبغ التقليدي للأنسجة باستعمال المجهر الضوئي أي ليس الغرض هو إعطاء لون معين للجسم المراد فحصه لتوضيحه وتمييزه عن بقية الأجسام في الخلية أو النسيج وإنما الغرض هو إحاطة الجسم المراد رؤيته بجزيئات معدن ثقيل لا يسمح لسيل الالكترونات من اختراق الجسم وتنحرف عنه وبالتالي يتكون ظل الجسم وهو الذي يراه الفاحص على الشاشة الفلورسنتية Fluorescent Screen  للمجهر أي أن ما نشاهده باستعمال المجهر الالكتروني هي صورة دقيقة لظل الجسم وليس الصورة الحقيقية له ولتحقيق هذا الغرض تستعمل العديد من أنواع الصبغات في دراسات المجهر الالكتروني وهي محاليل لمركبات تحوي معادن ثقيلة أهمها التنكستن واليورانيوم ومن أهم الصبغات المستعملة هي:

1) صبغة حامض التنكستك الفوسفاتي

تحضر صبغة حامض التنكستلك الفوسفاتي , PTA Phosphotungistic acid بتركيز 1-2 % مع الماء وهي تعمل ضمن مدى واسع من الأس الهيدروجيني ومع أنواع عديدة من المحاليل المنظمة وخاصة المنظم الفوسفاتي وهي من أفضل الصبغات المستعملة لأنها لا تتحد مع الجسيمات الفايروسية ولكن سلبيتها أنها قد تعمل على تحطيم جسيمات بعض أنواع الفايروسات.

2) صبغة خلات اليورانيل

تحضر صبغة "خلات اليورانيل" , UA Uranyl acetate بتركيز 1-2% مذابة في الماء غير المؤين وبدرجة أس هيدروجيني 3.5-4 وهي مناسبة لفحص معظم أنواع الفايروسات وتعطي وضوحا جيدا عند الفحص إلا أنه لا يفضل مزجها مع العصير النباتي مباشرة ولا مع المحلول المنظم الفوسفاتي لأنها قد تترسب كذلك فإن إطالة فترة الصبغ بها قد يجعلها تتفاعل مع الجسيمات الفايروسية لتتحول إلى صبغة موجبة.

3) صبغة موليبدات الأمونيوم

تمتاز صبغة موليبدات الأمونيوم" , AM Amonium molybdate بثباتيتها في الضوء وتعمل مع العديد من أنواع المحاليل المنظمة وبمديات أس هيدروجيني بين 3-9 إلا أنها الصبغة الأقل استعمالا من الصبغتين السابقتين لقلة وضوح صور الأجسام المصبوغة بها مقارنة بالصبغتين المذكورتين.

إن استعمال هذه الصبغات يؤدي إلى نوعين من حالات الصبغ للعينات وهما (1) الصبغ السالب Negative Staining والذي يحصل عند عدم حصول اتحاد بين الصبغة والجسيمات الفايروسية المراد فحصها وإنما إحاطة الصبغة بالجسيمات فقط وترسبها على سطحها وهذا النوع من الصبغ هو المفضل على النوع الثاني ويعطي صورا أكثر وضوحا ودقة ويطلق على الصبغات التي تعطي هذا النوع من الصبغ "الصبغات السالبة" (2) الصبغ الموجب Positive Staining في هذا النوع من الصبغ يتم تفاعل وتغلغل جزيئات الصبغة وخاصة المعدن الثقيل في الجسيمات الفايروسية المراد فحصها ويحصل ذلك بسبب تفاعل جزيئات المعدن الثقيل مع البروتين الفايروسي وتشربه لها مما يسبب انكماش الجسيمات وتغير شكلها بدرجة معينة وهي حالة غير مرغوب بها.

3. طرق الفحص بالمجهر الالكتروني النافذ

يستعمل المجهر إما مباشرة لرؤية الجسيمات الفايروسية في العصير النباتي من دون الحاجة لعمل شرائح في النبات أو يتم عمل شرائح دائمة في النسيج النباتي المصاب لرؤية الجسيمات الفايروسية في مواقعها الحقيقية داخل الخلايا ودراسة التغيرات الخلوية والنسيجية التي تسببها الفايروسات وخاصة الأجسام الضامة وتستعمل في كل هذه الطرق شريحة المجهر الالكتروني المسماة "الشبكة" Grid وهي عبارة عن قرص مشبك مصنوع من النحاس أو البلاتين بقطر 5 ملم، (الشكل 2) تغطى إحدى جهتيه بغشاء شفاف رقيق جدا من مادة "الفورمفار" Formvar البلاستيكية أو مادة "الكولويدن" Colloidin وهي مواد متحملة لسيل الالكترونات ثم تغطى بطبقة رقيقة من الكربون المبخر Evaporated carbon وذلك لدعم العينة على الشريحة.

الشكل (2): شريحة المجهر الالكتروني الشبكية. Grid

1. فحص الجسيمات الفايروسية مباشرة في العصير النباتي

يتم ذلك بطريقتين رئيسيتين هما:

أ- طريقة التغطيس السريع

طريقة التغطيس السريع Quick dip method هي طريقة سريعة وسهلة الانجاز ولا تستغرق أكثر من ساعة وتنفذ بوضع قطرة من محلول صبغة المعدن الثقيل، على شريحة المجهر ثم تقطع الورقة المصابة إلى قطع مثلثية صغيرة ويغمر الجزء المدبب لكل منها لعدة ثواني في القطرة وبذلك سينسحب العصير النباتي بما يحويه من جسيمات فايروسية إلى قطرة الصبغة بتأثير الشد السطحي للسائل وبعد جفاف القطرة يتم إدخال الشريحة في أنبوبة المجهر لفحص الجسيمات الفايروسية.

ب - الفحص المباشر للعصير النباتي

يسحق النسيج النباتي المصاب مع كمية مناسبة من محلول منظم للحصول على العصير النباتي الحاوي على الجسيمات الفايروسية ويعرض العصير إلى انتباذ بسرعة 5000 دورة/دقيقة لمدة 10 دقائق ثم توضع كمية 10-20 ميكروليتر من المحلول الرائق في كل حفرة من حفر طبق العينات البلاستيكي الدقيق Plastic microwell miniplate ثم توضع شريحة المجهر فوق كل حفرة بحيث يلامس سطح الشريحة المغطى بالفورمفار وتترك لعدة دقائق ثم ترفع وتجفف ثم تفحص، يمكن الاستعاضة عن طبق العينات البلاستيكي باستعمال شريحة مجهر ضوئي زجاجية توضع عليها قطرة العصير وتلقى فوقها باحتراس شريحة المجهر الالكتروني لعدة دقائق ثم ترفع وتجفف وتفحص.

2. فحص الجسيمات الفايروسية داخل النسيج النباتي

يتم ذلك بعمل شرائح دائمة للنسيج النباتي المصاب الذي يخضع لإجراءات سحب الماء من النسيج Dehydration باستعمال تراكيز متدرجة من الأسيتون ثم تعقبها عملية تثبيت النسيج Fixation باستعمال مركب رابع أكسيد الاوزميوم " , OsO₃ Osmium tetraoxide ثم عملية الطمر Embedding في مادة راتنجية تتصلب على العينة لتقطع بعد ذلك إلى قطاعات رقيقة جدا بواسطة جهاز المايكروتوم الفائق Ultra microtome ثم يلصق كل قطاع على شريحة المجهر ويفحص بعد صبغها بإحدى الصبغات المستعملة، إن إجراءات تحضير العينة التي ذكرت هي شديدة التأثير على الجسيمات الفايروسية وقد تتلفها وأن أكثر المركبات تأثيرا على الفايروسات هو مركب رابع أكسيد الأوزميوم.

3. الفحص بالمجهر الالكتروني المبرد وإعادة تركيب الصورة

 Cryo-EM and Image Reconstruction method

تعد هذه الطريقة أحدى التطويرات الهامة التي أدخلت لتحسين رؤية الجسيمات الفايروسية بالمجهر الالكتروني حيث أدت إلى تحسين كبير في وضوح الصورة مقارنة بطريقة الصبغ السالب، (الجدول ادناه) إذ وصلت درجة الوضوح Resolution إلى تسعة أنكسترومات وهي دقة مشاهدة لا يمكن الوصول إليها إلا بطريقة "حيود الأشعة السينية" X-ray diffraction، وتحافظ هذه الطريقة المطورة على التركيبة المائية Hydrated Structure للجسيمات الفايروسية أي على شكلها الطبيعي في الخلية وتقلل التأثير المتلف لسيل الالكترونات عليها إلى أدنى حد ممكن، وتعتمد هذه الطريقة على مبدأ "التشتت" Defocus بدل اعتمادها على الصبغ بمعدن ثقيل حيث يضاف المحلول الفايروسي المنقى والمركز على شريحة المجهر المدعمة بالفورمفار والمغطاة بالكربون وتغطس فورا في محلول التجميد Liquid Cryogen حيث يستعمل محلول الإيثان Ethane أو البروبان Propane فتصبح العينة مزججة Vitrified Sample بسبب التجميد العالي ثم تنقل مباشرة للفحص بالمجهر النافذ المزود بحامل خاص للشريحة المجمدة Cryospecimen holder وبأقل جرعة من سيل الالكترونات لتجنب تحطم العينة ثم تصور العينة على فلم خاص من النوع  CCDلتبدأ بعدها عملية معالجة الصورة لإعطاء صور ثلاثية الأبعاد للجسيمات الفايروسية تشكل من الصور ثنائية الأبعاد الأصلية لتعطي تفاصيل دقيقة عن كيفية تنظيم وترتيب الوحدات البروتينية المكونة للغطاء وهي المعلومات التي كان يتطلب سنوات من العمل مع الأشعة السينية للحصول عليها والتي اختصرت إلى أقل من أسبوع في هذه الطريقة، إلا أن سلبية هذه الطريقة هي ارتفاع ثمن المجهر الالكتروني المبرد والحاجة إلى متخصصين متدربين على استعماله كذلك لا تتعامل هذه الطريقة إلا مع محاليل فايروسية عالية النقاوة خالية من الشوائب النباتية وليس مع العصير النباتي الخام وهذا يتطلب تنقية الفايروس المراد دراسته وهذه العملية معقدة وقد تفشل مع بعض الفايروسات.

جدول يبين درجة الوضوح Resolution لصور بعض أنواع فايروسات النبات باستعمال طريقة المجهر الالكتروني المبرد وإعادة تركيب الصورة

4. دراسة أبعاد الجسيمات الفايروسية باستعمال المجهر الالكتروني النافذ

يستفاد من هذا المجهر لدراسة أبعاد الفريونات أي أطوال وأقطار الفايروسات العصوية والباسيلية وأقطار الفايروسات البلورية ولهذه الدراسات قيمتها التشخيصية لأن لكل فايروس أبعاده الخاصة وتنفذ الطريقة التقليدية لحساب أبعاد الجسيمات الفايروسية بالحصول على مائة صورة فوتوغرافية لجسيمات الفايروس المراد قياس أبعاده حيث تحسب أبعاد صورة كل جسيمة فايروسية بالملمتر على الصورة الفوتوغرافية ثم تحسب بالنانومتر وفق المعادلة التالية: البعد الحقيقي للفايروس بالنانومتر = طول الجسيمة بالملمتر في الصورة الفوتوغرافية × 1000000 / قوة تكبير الصورة بالمجهر الالكتروني.

وبذلك يتم الحصول على أبعاد صور مائة جسيمة ليتم بعد ذلك استخراج "الطول الشائع" Normal length or Modal length لذلك الفايروس وهو الذي يمثل الطول الحقيقي للفايروس لأنه يمثل طول الغالبية العظمى من الجسيمات الفايروسية المائة والذي يستخرج بعمل مدرج تكراري Histogram للجسيمات المائة بعد توزيعها على فئات الأطوال وحساب عدد الجسيمات في كل فئة طولية وكما مبين في الشكل (3). يعود التباين في أبعاد جسيمات الفايروس في العينة المفحوصة بالمجهر الإلكتروني إلى تأثير المعاملات الفيزيائية والكيميائية التي يتعرض لها الفايروس عند إعداد العينة للفحص حيث يسبب ذلك تكسير بعض الجسيمات فتظهر أقصر طولا من الطبيعية كما تؤثر بعض الكيماويات مسببة زيادة أو نقص أطوال الجسيمات فوجد مثلا أن فايروس موزائيك البنج (HMV) تظهر جسيماته طويلة ومستقيمة عند معاملتها بأيونات البوتاسيوم فيما تظهر قصيرة ومرنة عند معاملتها بمركب EDTA أما ظهور الجسيمات الأطول من الطول الطبيعي للفايروس فيعود إلى ظاهرة التحام الجسيمات العصوية مع بعضها من طرفيها.

جرى تطوير لطريقة قياس أقطار الجسيمات البلورية وذلك بمزج المحول الفايروسي النقي مع حبيبات اللاتكس الكروية المنتظمة Polysterene latex المعروفة الأقطار والتي تظهر مع جسيمات الفايروس في الصورة الفوتوغرافية وبالمقارنة مع أقطارها المعروفة يمكن معرفة قطر جسيمة الفايروس تحت الدراسة.

الشكل (3): كيفية إعداد المدرج التكراري لقياس الطول الشائع للفريونات.

(أ) المدرج التكراري العلوي هو لجسيمات فايروس البطاطا أكس (PVX) حيث أن أعلى مدرج هو الذي متوسط الطول 513 نانومتر والذي يمثل الطول الشائع للفايروس وأستخرج هذا من 120 صورة جسيمة حيث وقعت غالبية الجسيمات ضمن هذا الطول وكما يبدوا من قيم المحور الصادي، فيما ظهرت جسيمات أقصر وأطول خارج هذا الطول والتي تهمل، أما المدرج التكراري السفلي فهو لجسيمات فايروس موزائيك التبغ (TMV) والذي يبين أن الطول الشائع للفايروس هو 299 نانومتر واستخرج من 1200 صورة جسيمة.

(ب) المدرج التكراري لتوزيع أطوال جسيمات فايروس خشخشة التبغ (TRV) المكون من جسميتين، الأولى طويلة يبلغ طولها الشائع 197 نانومتر والثانية 52 نانومتر واستخرج ذلك من 200 صورة جسيمة.

الشكل مقتبس من Noordam (1973).