التشخيص بتقانة تفاعل تسلسل البوليميريز PCR

تمت تهيئة أرضية ابتكار هذا الاختبار الهام سنة 1955 عندما أكتشف " كورنبرج"

Kornberg الإنزيم الخلوي DNA polymerase وهو الإنزيم المسئول عن تضاعف وإصلاح حامض الدنا وحاز على جائزة نوبل جراء هذا الاكتشاف، وجاءت سنة 1983 لتشهد ابتكار تقانة تفاعل تسلسل البوليميريز Polymerase Chain Reaction , PCR من قبل "مولس" Mullis ونال أيضا جائزة نوبل في الكيمياء على هذا الابتكار الذي خلق ثورة في الكشف عن الفايروسات وتشخيصها فضلا عن استعمالاته في العديد من الجوانب العلمية الأخرى، وجاء تعريف هذه التقانة في براءة الاختراع الأمريكية التي رخصته كالاتي "هي العملية المتضمنة إنتاج خيوط تكاملية منفصلة للحامض النووي المستهدف بواسطة فائض مولاري من بادئين قصيري النيوكليوتايدات ثم إطالة البادئين لإنتاج نواتج مستنسخة تعمل قالبا لتخليق التعاقب النيوكليوتايدي الكامل للحامض النووي المطلوب وبذلك أصبح هذا الاختبار من أهم التقانات المستعملة في تشخيص أمراض النبات بالكشف عن جينوم الممرض بواسطة الاستنساخ (الكلونة) عالي الكفاءة للتعاقبات النيوكليوتايدية لقطعة صغيرة منه لإنتاج ملايين النسخ الكاملة الجديدة عن طريق آلية "الدورات الحرارية المؤتمتة" Automated thermal Cycler حيث يتم تضخيم تلك القطعة الصغيرة والتي قد لا يزيد حجمها عن 50 نيوكليوتايدة لتصل بواسطة الدورات التضاعفية إلى مليون ضعف Million fold خلال 3-4 ساعات، وهذا الاختبار هو عالي الحساسية والتخصص بقدرته على تمييز التعاقبات النيوكليوتايدية المختلفة عن بعضها في نيوكليوتايدة واحدة وبالتالي لديه قدرة الكشف عن أي طفرة حصلت في الجينوم، وقد استعمل لأول مرة في تشخيص فايروسات النبات سنة 1990، حيث شمل استعماله أنواع من الفايروسات تعود للأنواع الأربعة من الجينومات الفايروسية:, dsDNA  , ssRNA , ssDNA dsRNA حيث شخصت به انواع تعود لأجناس Alfamovirus و Capillovirus و Caulimovirus و Cucumovirus و Fijivirus و Foveavirus و Furovirus و Idaeovirus و Ilarvirus و Nanovirus و Nepovirus و Potexvirus و Sobemovirus و Tobamovirus و Tobravirus و Tombusvirus و Tospovirus و Trichovirus و Umbravirus و Vitivirus وأيضا لأنواع من الفايروسات تعود لعوائل Closteroviridae و Geminiviridae و Luteoviridae وهذا يعني تم تصميم بوادى Primers لكل هذه الأنواع وأنها أصبحت متوفرة تجاريا لأغراض التشخيص.

إن اختبار PCR الأساسي مصمم للتعامل مع الدنا فقط وهذا يعني عدم قدرته على تشخيص الفايروسات ذات الجينوم الرايبي ولغرض جعله صالحا لهذه الفايروسات وكذلك للفايرويدات فقد تمت إضافة خطوة تطويرية له ليظهر الاختبار المسمى " تفاعل تسلسل البوليميريز بالاستنساخ العكسي" Reverse Transcription-PCR ويعرف اختصارا -RT PCR والذي أصبح لديه قدرة تحويل الرنا الفايروسي إلى الدنا أولا ثم إجراء عملية التضخيم بواسطة اختبار PCR التقليدي.

استعمل اختبار PCR بنوعيه وبنجاح كبير لتضخيم كامل جينومات العديد من أنواع الفايروسات أو لجزء من جينوماتها وكذلك لكامل جينومات الفايرويدات ومع العديد من أنواع النباتات العائلة من ذوات الفلقة والفلقتين والصنوبريات كما استعمل أيضا للكشف عن الفايروسات في ناقلاتها حيث استعمل مع المن والبق الدقيقي والذباب الأبيض والثربس وقفازات الأوراق والنيماتودا، واستعمل أيضا في الكشف عن الفايروسات في الحشرات السابتة ودراسة تغايرية الفايروسات ولمسح النباتات المعدلة وراثيا ودراسة الاستنساخ الجزيئي Molecular Cloning للجينومات الفايروسية وتعاقب نيوكليوتايداتها والكشف عن الفايروسات في المياه والتربة.

1. الية تقانة تفاعل تسلسل البوليميريز

يتم التفاعل بعملية تهجين وإطالة Annealing قطعة الحامض النووي المستهدفة بتوسيعها إنزيميا Enzymatic extension باستعمال أثنين من "البوادى قصيرة النيوكليوتايدات" Oligonucleotide primers كل منها بحجم 16-30 نيوكليوتايدة والتي ترتبط مع المنطقة المستهدفة في خيط الدنا ليزدوج معه مكونا "مزدوج الدنا" المسمى Duplex DNA بواسطة إنزيم خاص بهذا الاختبار هو "إنزيم بلمرة الدنا الثابت حراريا" Thermoresistant DNA polymerase القادر علي الاحتفاظ بفاعليته عند درجات الحرارة العالية. يلخص الشكل (1) الية التفاعل المكونة من ثلاث دورات حيث تضم الدورة الأولى الخطوات الأتية (1) دنترة الدنا المزدوج بتسخينه إلى 94-98م فينفصل خيطاه ويصبحان مهيئين للارتباط بالبوادي (2) تبريد المتفاعلين إلى 72م عندها سيرتبط كل بادى مع الجزء المناسب له من خيط الدنا ويتكامل معه وبذلك يتحول إلى "بادى مهجن متطاول" Annealed primer (3) يحضن المزيج عند 37-65م للسماح لإنزيم بلمرة الدنا بإطالة البادئ ليكون خيط دنا جديد متكامل مع خيط الدنا الأصلي. تبدأ الدورة الثانية مباشرة بعد انتهاء الأولى حيث تعاد دورة التسخين والتبريد وبذلك ينفصل خيطي الدنا وتبدأ بوادي جديدة بالعمل عليها لتضخيمها (تضاعفها) وكما موضح في الخطوتين 4 و5 من الشكل (1) أما الدورة الثالثة للتفاعل فتعيد تكرار الدورتين السابقتين وبذلك يتضاعف الحامض النووي ملايين المرات وهو الذي بدأ في الدورة الأولى بقطعة من الحامض والتي يطلق عليها "الإشارة الجزيئية Molecular Signal وذلك في دورات تسخين وتبريد تمتد من 30 ثانية إلى عدة دقائق. يتم الحصول على نتائج الاختبار بالكشف عن حزم الدنا المضخم بعد نقلها إلى صحيفة الهلام وفصلها بطريقة الترحيل الكهربائي ومقارنتها مع دنا معلوم الوزن الجزيئي كما مبين في الشكل (2) حيث استعمل الاختبار لتشخيص سلالتين من فايروس موزائيك الزكيني (ZYMV) وهما السلالة المعتدلة (ZYMV-MD) والسلالة الشديدة (ZYMV-SV)، ينفذ هذا الاختبار بكامل دوراته الثلاثة في جهاز PCR machine "PCR والمبين في الشكل (3). وجرى تطوير على الاختبار الأساسي لتفاعل تسلسل البوليميريز ليكون ملائما للتمييز بين سلالات الفايروسات حيث طورت طريقة "التعدد الشكلي المقيد لطول الشظية"Restriction fragment length polymorphism, RFLP والتي أثبتت كفاءة عالية في التمييز بين سلالات النوع الواحد، وطورت طريقة "تفاعل تسلسل البوليميريز المضاعف" Multiplex -PCR والتي سمحت بإجراء تضخيم متواقت لعدة أنواع من الفايروسات أو الفايرويدات باستعمال مزيج من أزواج البوادي المتخصصة وبالتالي قلصت هذه الطريقة من كلف التشخيص بتقليصها لعدد الاختبارات المطلوب انجازها.

2. إعداد العينة النباتية للفحص بتقانة PCR

يعد إعداد العينات النباتية للفحص أصعب من إعداد العينات البشرية والحيوانية حيث يتطلب سحقها مما يؤدي إلى إطلاق مواد تتداخل سلبيا مع نتائج الاختبار وهي السكريات المعقدة والفينولات وخاصة في النباتات الخشبية لذا يضطر الباحث لسحق العينة في محلول منظم أو الماء المقطر وتخفيف العصير لغرض التخلص من تأثير هذه المواد مما يسبب تقليل حساسة الاختبار لذا فان البديل هو (1) استخلاص الأحماض النووية بواسطة الفينول أو الكلوروفورم لإزالة البروتينات النباتية ثم استرجاع الأحماض النووية من المستخلص بترسيبها بواسطة الايثانول أو الأيزوبروبانول ويعاد إذابتها في الماء وتستعمل في الاختبار (2) استعمال النتروجين المسال لغرض التجميد السريع للعينة النباتية فتتحول إلى مسحوق مباشرة دون السماح لها بالذوبان (3) استعمال طريقة الجذب المناعي" Immunoaffinity method أو تسمى تفاعل تسلسل البوليميريز بالاصطياد المناعي" Immuno-Capture- PCR وذلك لاصطياد الجسيمات الفايروسية نقية من العصير النباتي وهي طريقة طورت أصلا للتعامل مع الفايروسات الحيوانية وتسمى "تفاعل تسلسل البوليميريز باصطياد المستضد" Antigen-Capture- PCR، (4) استعمال طريقة تفاعل تسلسل البوليميريز بالاصطياد البصمي " Print-Capture - PCR والتي يطلق عليه اختصارا PC - PCR هي طريقة تعطي إمكانية الكشف عن الفايروس دون الحاجة لسحق العينة بل اصطياد الفايروس على أغشية النايتروسيليلوز أو النايلون كما يمكن اصطياد الأحماض النووية على جزيئات السليكا (5) استعمال طريقة "الراتنج المحرر للجين" Gene Relaser ^TM Matrix ويتوفر هذا الراتنج تجاريا ويستعمل مع العصير النباتي الخام لقدرته على إزالة الملوثات من عصير أنواع مختلفة من النباتات منها التبغ والعنب والتفاح والخوخ والمشمش.

3. الإنزيمات المستعملة في تقانة PCR

تتوفر حاليا أنواع من إنزيم "بلمرة الدنا الثابت حراريا" وأكثرها استعمالا هو الإنزيم المعروف باسم Taq polymerase المعزول من بكتريا الينابيع الحارة المقاومة للحرارة واسمها العلمي Thermus aquaticus ومنها اشتق اسم الإنزيم والذي يستعمل مع الدنا أما مع الفايروسات ذات الجينوم الرايبي RNA والفايرويدات فيستعمل معها عادة نوعين من إنزيمات الاستنساخ العكسي RTase وهما الإنزيم AMV-RT المعزول من فايروس الطيور Avian myeloblastosis Virus والإنزيم MMLV-RT المعزول من فايروس اللوكيميا Moloney murine leukemia virus.

الشكل (1): آلية تفاعل تسلسل البوليميريز (PCR).

الدورة الأولى (1) تسخين الدنا لفصل (صهر) الخيطين (2) التبريد للسماح للبادئين بالتهجين والإطالة Annealing مع التعاقبات الهدف (3) التحضين للسماح لإنزيم البلمرة لاستطالة البو ادي.

الدورة الثانية (4) تسخين الدنا لفصل الخيطين ثانية (5) التبريد للسماح للبادئين بالتهجين والإطالة مع التعاقبات الهدف (تكرار للخطوة 2).

الدورة الثالثة : تكرار الدورتين الأولى والثانية مرة أخرى.

الشكل مقتبس من Cann (2005).

الشكل (2): تشخيص سلالتي فايروس الموزائيك الاصفر للزكيني (ZYMV) وهما السلالة المعتدلة (ZYMV-MD) والسلالة الشديدة (ZYMV-SV) حيث ظهرت حزمهما في الهلام مقارنة مع الدنا المعلوم الوزن الجزيئي.
الشكل مقتبس من Agrios (2005).

الشكل (3): جهاز PCR نوع ABI 7700 quantitative PCR machine

الشكل مقتبس من Strange (2003).

4. البوادي

استعملت العديد من أنواع بوادي التضخيم المتخصصة Primers إزاء عدة عوائل فايروسية وهي Tombusviridae , Potyviridae , Luteoviridae , Geminiviridae  حيث تستهدف هذه البوادي المناطق المحفوظة في الجينوم Conserved regions والتي تتماثل في العديد من الفايروسات، ولكن قد يتم اختيار بوادي متخصصة جدا قادرة على التمييز بين سلالات النوع الفايروسي الواحد وبذلك طورت بوادي على مستوى السلالة واستعملت لتمييز سلالات فايروس جدري الأجاص (PPV) وكذلك لتشخيص سلالة الكرز التابعة لفايروس التبقع الحلقي التماوتي للأجاص (PNRSV).

5. طريقة الكشف عن نتائج اختبار تفاعل تسلسل البوليميريز PCR

يتم الكشف عن الدنا المضخم الناتج من الاختبار بإخضاع الناتج إلى الترحيل الكهربي في هلام البولي اكريل امايد حيث تنفصل حزم الدنا المضخم والتي تصبغ بصبغة نترات الفضة Silver nitrate بصبغة بروميد الايثيديوم Ethidium bromide فتصبح واضحة للفحص البصري أو يتم الكشف عن الدنا المضخم بواسطة مجسات معلمة Labeled probes كما يمكن الكشف عن النواتج باستعمال أغشية النايتروسيليلوز أو النايلون بتعليم الدنا المضخم بمركب البايوتين Biotin وذلك بدلا من طريقة الترحيل الكهربائي.

استعملت أيضا البوادي المعلمة بجزيئات مفلورة Fluorescent molecules حيث يفحص ناتج تفاعل تسلسل البوليميريز بالطريقة المسماة "الكشف الفلورسنتي المثار بالليزر" Laser-excited fluorescence detection وكذلك استعملت طريقة "الكشف بالإنزيم المفلور المحلل للحامض النووي " Fluoregenic nuclease detection باستعمال النظام الإنزيمي Taq Man ^Tm لتشخيص فايروس التفاف أوراق البطاطا PLRV)) و فايروس موزائيك قصب السكر (SCMV).

6. التقانات المطورة لاختبار تفاعل تسلسل البوليميريز

1) تقانة تفاعل تسلسل البوليميريز الفوري Real time PCR

أجري هذا التطوير للطريقة الأساسية من اجل الحصول على نتائج الاختبار بشكل فوري وتجنب تمرير الناتج وهو الدنا المضخم في الهلام لملاحظة "الامبليكونات" Amplicons وما يتطلبه ذلك من وقت لعدة ساعات لظهور النتائج بشكل حزم في الهلام، يجرى هذا الاختبار في طبق الاليزا بإضافة مجس معلّم بصبغة فلورسنتية مع مادة مخمدة Quencher حيث يقوم المجس بالتقاط الامبليكون، وبعد حصول البلمرة يعمل إنزيم Taq polymerase على نشر الصبغة الفلورسنتية ومادتها المخمدة مما يسهل عملية الكشف عن النتيجة في الطبق بسبب الفلورة وانبعاث الضوء ونقله بواسطة ألياف بصرية Fiber optics ولقد استعملت هذه التقانة في الكشف الفوري عن فايروس تكتل قمة البطاطا (PMTV).

2) تقانة الاليزا – تفاعل تسلسل البوليميريز ELISA-PCR

هي التقانة الأحدث التي جمعت بين اختباري الاليزا وPCR للكشف عن الفايروسات والفايرويدات، حيث يتم أولا تهجين قطعة صغيرة من التعاقب النيوكليوتايدي الفايروسي المعدل المرتبط بالبايوتين وتحويلها إلى أميليكونات خاصة يطلق عليها مصطلح Digoxigenine - dUTP labeled RT-PCR amplicons ثم يتم اصطياد هجين مجس الامبليكون على سطح طبق الاختبار المغطى بمركب الستربتافيدين Streptavidin حيث يمثل الطبق الطور الصلب تفاعل البايوتين مع الأفيدين" Avidin-Biotin interaction ثم يكشف عن الامبليكون المهجن بواسطة "أضداد الديكوزيجينين المعلمة بالانزيم"Enzyme- conjugated anti-DIG antibodies  وهي الأضداد المضادة لمركب " الديكوزيجينين" , DIG Digoxigenine. ويبين الشكل (4) آلية تنفيذ هذه التقانة.

تعد هذه التقانة هي الأدق والأكثر حساسية في الكشف عن الفايروسات وبقية ممرضات النبات مقارنة باختبار PCR الأساسي وبقية الطرق المطورة منه حيث تزيد حساسيته بمقدار 10-100 ضعف عن الاختبار الأساسي، فضلا عن استغنائه عن الترحيل الكهربي في الهلام وكذلك انخفاض كلفته.

الشكل (4): مخطط تقانة الاليزا– تفاعل تسلسل البوليميريز ELISA-PCR

(1) ربط مركب Digoxigenine - dUTP مع خيطي الحامض النووي المراد تضخيمه (2) دنترة الحامض النووي وتهجينه مع "مجس معلم بالبايوتين" قادر على اصطياد خيط نيوكليوتايدات قصير (Biotin-labeled Oligonucleotide Capture probe) (3) تثبيت ناتج التهجين على طبق التخافيف الدقيقة (Microtiter plate) المغطاة حفره بالمركب " ستربتافيدين" Streptavidin)) (4) إضافة أضداد الديكوزيجينين المعلمة بإنزيم البيروكسيديز مع المادة الأساس ABTS والتي تكشف عن الناتج.

الشكل مقتبس من Strange، (2003).

7. مزايا وعيوب تقانة تفاعل تسلسل البوليميريز

يمتاز الاختبار بالمزايا التالية (1) يكشف عن الفايروسات والفايرويدات المنخفضة التركيز جدا في النبات والتي لا تتحسسها طرق التشخيص الأخرى، حيث يتحسس وجود الفايروس في حشرة أو حبة لقاح أو بوغ فطري واحد (2) الكشف الدقيق عن سلالات الفايروس الواحد وذلك بتصميم بوادي متخصصة جدا علي مستوي السلالة (3) تصميم بوادي متخصصة على الدنا أو نسخة الدنا CDNA للفايروس تحت الدراسة من عينات غير متجانسة مما يلغي الحاجة إلى تنقية الفايروس من أنسجة النبات المصاب.

أما عيوبه فهي (1) الكلفة المادية العالية لتجهيز المختبر المتخصص بهذا الاختبار مع الحاجة إلى كادر عالي التدريب (2) الاحتمال الكبير لحدوث تلوث في العينات أثناء إعدادها (3) الخطأ المحتمل في المعلومات المتعلقة بالتعاقب النيوكليوتايدي المستهدف Target Sequence مما يؤدي إلى خطأ في تصميم البوادي.