الكشف السيرولوجي عن الفيروسات (اختبار ELISA)

تعتبر طريقة (Enzyme-linked Immunosorbent assay) ELISA احدى طرق التشخيص السيرولوجية للأمراض وهي تعتبر لذلك اهم هذه الطرق المستخدمة الان في تعريف الفيروسات النباتية وقد وجد Clark & Adams سنة 1977 ان طريقة ELISA باستخدام الاطباق تعتبر طريقة دقيقة وكافية لتحديد واختبار وجود الفيروسات النباتية في جميع المحاصيل للكشف عن الفيروسات في الاجزاء النباتية او العوائل الحشرية وفي البذور والنباتات المتكاثرة خضريا وقد كان لتطوير هذه الطريقة وطرق تقنية اخرى للتدقيق وسرعة الكشف عن عدد كبير من العينات النباتية في فترة قصيرة والوصول الى تكلفة قليلة Hamoton et al, 1990, Abou Zeid et al, 1990 Mahmoud et al1996, , Baldauf et al.2006

ومنذ هذا الوقت اصبحت هذه الطريقة واسعة الانتشار حتى انه يتم تطبيقها على النطاق التجاري لعديد من الفيروسات والبكتيريا والفطريات. ويمتاز هذا الاختبار بسهولة اجرائه والحساسية الشديدة والدقة كما انه سريع النتائج بالمقارنة بالطرق الاخرى للكشف عن الفيروس. و يجب التأكيد علي ان هذا الاختبار شائع الاستخدام ويمكن اجراؤه بسهولة وتتوافر المواد اللازمة لإجرائه خلال شركات متخصصة مما يسهل استخدامه مصاحبا لإجراءات وخطوات زراعة الانسجة. وتنقسم الطريقة الى طريقة مباشرة واخرى غير مباشرة الا ان النتائج تكون متطابقة والاختلاف في الطريقة غير المباشرة هو اضافة انزيم اضافي للتفاعل

Clark and Bar-Joseph, 1984) ).

ويعتمد في الكشف على ان الفيروس يتكون من حمض نووي محاط بغلاف بروتيني مميز. ولذلك فانه ينتج اجساما مضادة في احد الحيوانات ذات الدم الحار وتستخدم هذه الاجسام المضادة بعد فصلها من الحيوان وحين تتفاعل مع مستخلص النبات تعطي نتيجة ايجابية في حالة وجود الفيروس في مستخلص النبات. ولكي يمكن رؤية هذا التفاعل وتقديره كميا حيث يربط بأنزيم يعطي تفاعلا لونيا واضحا (انظر الشكلين في الاسفل). مما هو جدير بالذكر ان هذا الاختبار لا يجدي في الكشف عن الفيرويد وهو مسبب مرضى لا يملك غطاء بروتينيا.

قبل الاستطراد في هذه الطريقة يجب تعريف بعض المصطلحات التي تستخدم مثل Antigen-Antibodies - Antiserum.

اولا: Antigen الانتيجين

تعرف الانتيجينات على انها جزيئات تحتوي على بروتين او عديدة التسكر Polysaccharides وهذه الجزيئات تعتبر اجساما غريبة اذا ما تم حقن انواع من الفقاريات بها وتشمل هذه الانتيجينات تحضيرات الفيروس النباتي او الحيواني والفطريات وجراثيم البكتيريا وغير ذلك. هذا الانتيجين له قدرة على تنشيط الجهاز المناعي للحيوان المحقون به لإنتاج نوع معين من البروتينات يطلق عليها Antibodies التي تكون في سيرم هذا الحيوان وفي هذه الحالة يطلق على السيرم Antiserum (سيرام مضاد) هذا الاخير له القدرة على التفاعل او الاتحاد مع هذا الانتيجين.

ثانيا: الاجسام المضادة Antibodies

وهي اجسام مضادة تنتج في دم الحيوانات الفقارية نتيجة لوجود انتيجين غريب في دم هذه الحيوانات وهي نوع من البروتينات عالية التخصص تعرف باسم Immunoglobulins او  IgGوهذا البروتين قادر على الاتحاد بالانتيجين الخاص به.

ثالثا: السيرم المضاد Antiserums

وهو ما يطلق عليه السيرام المضاد للفيروسات النباتية في هذه الحالة. ويمكن انتاجه في عديد من الحيوانات ولكن يعتبر الارنب هو الحيوان الرئيس لعدة اعتبارات منها انتاجه الجيد للسيرام المضاد للفيروسات النباتية كما يسهل التعامل مع الحيوان ولكن هذا لا يمنع من استخدام حيوانات اخرى مثل الفئران وخنازير غينيا والدجاج وغير ذلك. ويتم فصل IgG من الدم بطرق تنقية معينة خلال ترشيح بواسطة فلاتر خاصة.

فوائد استخدام طريقة ELISA

أ- من اكثر الاختبارات حساسية لتشخيص معظم الفيروسات والتي تتضمن فيروسات البطاطس مثل PLRV ، PVA التي تكون بتركيز منخفض في العائل كذلك الحال في فيروس تورد الموز bunchy top virus)).

ب- يحتاج الاختبار الى كمية قليلة جدا من السيرام المضاد بالمقارنة بغيره من الطرق السيرولوجية الاخرى.

ج) يمكن اجراء عدد كبير من العينات في وقت قصير وقد يعاب على هذا الاختبار كثرة الخطوات المتبعة للحصول على النتيجة وقد امكن حاليا اختصار في وقت التحضين واستخدام اطباق سابقة التجهيز بالسيرم مما يؤكد ان هذا الاختبار يمكن تعديله واتباعه في برامج انتاج وتحسين التقاوي او الطرق الخاصة بالتربية لإنتاج اصناف مقاومة.

والشكل التالي يمثل الخطوات الاساسية المتبعة في طريقة ال ELISA وهي الطريقة المباشرة "Direct double antibody sandwich method"

شكل يوضح خطوات التفاعل في الطريقة المباشرة Direct ELISA

طريقة الاختبار

اولا: تغطية الاطباق بالسيرم المضاد المتخصص

وهي الخطوة الاولى ونقم فيها بتغطية جميع الثقوب الموجودة في الطبق البلاستيك عدد ٩٦ ثقبا بالمصل المضاد المتخصص وهو بروتين شديد التخصص IgG ويحتاج هذا الى تحضير محلول منظم buffer وهذا المحلول يمكن الاحتفاظ به في الثلاجة على درجة 4 م لمدة شهر واحد ويتركب من المواد التالية:

Coating Buffer

1.59 g Na CO₃

2.9 g Na HCO₃

- يخفف السيرم المضاد والمنقى IgG باستخدام المحلول المنظم السابق ويعمل فيه تخفيفات 10000/ 1000.1/ 1000.1/1 حسب تركيز السيرم والاجسام المضادة به.

- يضاف ۱۰۰-۲۰۰ ميكرون بواسطة ماصة دقيقة من التخفيفات السابق الاشارة لها وذلك في كل ثقب من الطبق. ومن المعروف انه محلول المنظم PBS-tween بإضافة مادة PVP ٢ % له.

ثانيا: طحن واضافة العينات النباتية المحتوية على الفيروس

وهذه الخطوة تشمل طحن العينات في هذا المحلول المنظم بتخفيف 10/ 1 او 20 / 1 وذلك حسب تركيز الفيروس في نسيج العينة حيث ان الكمية الاقل من المحلول المنظم تعطى اعلى تركيزا من الفيروس - الطريقة العملية البسيطة هي الضغط على العينات في اكياس بلاستيك صغيرة بعد اضافة المحلول المنظم لها باستخدام انبوبة اختبار بالضغط عليها من الخارج ثم جمع العصير، كما يمكن ايضا استخدام جهاز طحن كهربائي ذي سرعات عالية بعد ذلك تملا الثقوب بالعينات باستخدام ماصة نظيفة لكل ثقب حتى لا يتم حدوث تلوث من عينة الى اخرى ويراعى ايضا وجود عينات سليمة في هذا الاختبار كما يجب ان يكون هناك عينات مصابة في نفس الطبق. ويكفي ثقب واحد لكل عينة الا ان بعض المعامل تفضل تكرار العينة مرتين، ويجب وضع العينات حسب خطة معينة ويجب تسجيل ذلك في جداول خاصة ليسهل الرجوع اليها، بعد ذلك تحضن الاطباق على درجة حرارة 4 م لليوم التالي او على درجة حرارة 37 م لمدة 4 – 6 ساعات بعد ذلك تغسل الاطباق كما سبق باستخدام محلول PBS-Tween .

ثالثا: اضافة المصل المضاد المرتبط بالأنزيم

بالرغم من ان هناك انزيمات مختلفة يمكن استخدامها لربط المصل المضاد الا ان alkaline phosphatase, peroxidase يعطي نتائج جيدة مع الفيروسات النباتية. يخفف الانزيم باستخدام محلول منظم PBS-Tween ويتم ذكر التخفيف الملائم على العبوة، بعد ذلك يضاف السيرام المعلم بالأنزيم الذي تم تخفيفه الى ثقوب الطبق ثم يحضن الطبق لمدة ساعتين على درجة حرارة الغرفة او على درجة حرارة 37م. بعد انتهاء مدة التحضين يغسل الطبق بالطريقة السابقة ثلاث مرات. ومن المعروف ان السيرم المرتبط بالأنزيم سوف يرتبط بجزيئات الفيروس الموجودة في العينة ان وجدت والمرتبطة بدورها بجدار الثقوب.

رابعا: اضافة مادة التفاعل Substrate

وهي عبارة عن مادة تتفاعل فقط مع الانزيم اذا وجد ولهذا التفاعل يستخدم المحلول

المنظم التالي:

Substrate Buffer

97ml Diethanolamine

 800 ml H₂O

pH 9.8 with HCl

الذي يذاب به مادة التفاعل Substrate التي تكون علي هيئه عصي في نهاية ورقة او على هيئه حبوب او مسحوق ويجب الاحتراس الشديد عند وزن هذه المادة او اذابتها لأنها سهلة التأكسد واذا تحول لونها الى اللون الاحمر فلا تستخدم وهي تحضر طازجة ويراعى عدم تعرضها الى الضوء لسهوله تاكسدها وتستخدم بتركيز 0.6-0.8 لكل مللي جرام من المحلول المنظم. يضاف 100 ميكرولتر لكل ثقب في الطبق ثم تحضن الاطباق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمده 10 – 30 دقيقة حسب نوع الفيروس المستخدم وربما تصل الى ساعة كاملة في بعض فيروسات الموالح.

وتتفاعل مادة التفاعل مع الثقوب التي بها عينات مصابة ويتحول لونها الى اللون الاصفر في حالة انزيم  phosphataseواللون الاصفر المحمر في حالة peroxidase وتتناسب كثافة اللون طرديا مع تركيز الفيروس في العينة وتسجل النتائج اما بالعين المجردة ويمكن قراءة هذه النتيجة بواسطة جهاز ELISA Reader حيث يحول الجهاز اللون وكثافته الى ارقام يمكن مقارنتها بالعينات المختلفة.

وهو جهاز خاص لقياس اللون على طول موجي 405 في حالة الانزيم الاول او 490 في حالة استخدام الانزيم الثاني. ويلاحظ انه يجب اضافة عينة تحتوي على الفيروس في كل طبق للمقارنة وايضا اضافة المحلول المنظم Buffer المستخدم في اذابة المكونات كما ذكر.

تنتج عديد من الشركات نظم كشف Kits تجاريا لفحص العينات النباتية للفيروسات المختلفة باستخدام ELISA وانزيم Peroxidase وتتلخص الطريقة لفحص فيروسات البطاطس فيما يلى:

1- تحضر العينات النباتية بطحنها في محلول منظم ثم اضافة ۱۰۰ ميكرولتر لكل ثقب من الطبق ثم التحضين على درجة حرارة ٢٠-٢٥ م او في الثلاجة لليوم التالي.

2- يحضر السيرم المعلم بالأنزيم Enzyme conjugate

3- يغسل الطبق ثلاث مرات على الاقل باستخدام PBS-tween المرفق مع kits.

4- اضفEnzyme conjugate  (lµ100) ويحضن على درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

5- حضر محلول substrate.

6- اغسل الطبق ثلاث مرات بواسطة المحلول المنظم السابق PBS-tween.

7- اضف substrate

8- حضن لمدة حسب نوع الفيروس، لاحظ الجدول التالي:

جدول يبين العلاقة ما بين نوع الفيروس ووقت التحضين

9- اوقف التفاعل بواسطة اسر lµ 50 حمض الكبريتيك.

10- قراءة النتائج وتسجيلها.

شكل احدي الكواشف التجارية ELISA Kits للكشف عن الفيروس في النباتات والنتائج المتحصل عليها

تحليل نتائج اختبارات ELISA

في حالة اخذ نتائج العينات بالعين المجردة فانه يمكن تقسيم التفاعل الى ما يلى:

1- لا يوجد تفاعل (-)no reaction

2- تفاعل خفيف +  mild reaction

3- تفاعل متوسط ++ moderate reaction

4- تفاعل شديد اي تركيز عال +++ high concentration

وعلى هذا فانه يجب ان يكون هناك عينات سليمة في كل طبق ليسهل المقارنة كذلك وجود عينات مصابة من هذا الفيروس في نفس الطبق ويجب القول ان هذه الطريقة غير دقيقة للحكم علي العينات فيها عدا ان يكون الفيروس ذا تركيز عال في العينات.

ولذلك يراعى استخدام جهاز ال ELISA لأنه يعطي قيما رقمية لكل من العينات السليمة healthy والمصابة infected. وعلى هذا نأخذ قيمة العينة السليمة (المقارنة) healthy بعد ضربها في ٢ اي مضاعفتها ثم نعتبر قيم العينات الاعلى من هذه القيمة مصابة.

وهناك طريقة اكثر دقة باستخدام المعادلة التالية مع مراعاة عمل مكررات:

(قيمه المصاب (-) قيمة السليم (+) الانحراف المعياري × ضعف قيمة السليم ).

ولتقيلي تكلفة الاختبار يمكن تجميع العينات ذات الاعداد الكبيرة في مجموعات كل يحتوي على 10 نباتات واعتبارها عينة واحدة واختبارها سويا اي باعتبارها اختبارا واحدا وفي حالة النتائج الموجبة اي يوجد اصابة يتم استبعاد هذه العينة المجمعة كليا والتي تحتوي على 10 نباتات او اعادة فحص هذه العينة كل نبات على حدة ثم استبعاد ما هو مصاب هذا وفي حالة الاعداد الصغيرة يتم فحص كل العينات المفردة. مع الاخذ في الاعتبار ان ما يخدم هدف زراعة الانسجة من اجراء الاختبار التأكد من عدم وجود الاصابة الفيروسية في العينات وليس تحديد نوع الفيروس.

المشاكل الفنية التي تظهر باستخدام ELISA

1- عدم تكون لون في الطبق:

فيكون الاحتمال نسيان احدى الخطوات او استخدام محلول منظم مختلف او الانزيم والسيرم غير فعال فيراعى النظر الى تاريخ الصلاحية او طريقة التخزين وعمل positive في كل طبق واختبار الانزيم لعلاج هذه المشاكل.

2- تكون لون في جميع انحاء الطبق بدون تخصص:

يكون السبب هو ان السيرم غير نقي اي يحتوي على سيرم مضاد لبروتين النبات نفسه او عدم غسل الطبق جيدا او خطا في وضع النبات ولذلك يراعى وجود healthy في الطبق واستخدام سيرم اكثر تخصصا واستخدام Substrate طازج ويغطي الطبق اثناء التحضين.

3- وجود الاصفرار في الاماكن الخطأ:

اما ان يكون الغسيل غير كامل او خطا في وضع وتسجيل العينات او ان هناك محلولا من بعض الثقوب انتقل الى ثقوب اخرى مجاورة وفي هذه الحالة ينصح بالغسيل الجيد او زيادة خطوة للغسيل او استخدام اغطية للطبق مع الحرص في التداول، كما يجب تجفيف الطبق او الحواف بعد الغسيل.

4- ظهور اللون بسرعه جدا:

يكون السبب اما ان الانزيم ذو تركيز عال جدا او ان ال Substrate تركيزها عال وينصح باستخدام انزيم و Substrate ذات تركيز يعطي قراءة 1 على جهاز ELISA في فترة من 30-60 دقيقة على انتيجين قوي في ظروف التحضين المستخدمة.

شكل جهاز ELISA Reader لقراءة نتائج التحليل للعينات وتحويلها الى نتائج رقمية وتخزينها في الحاسوب (الكمبيوتر).

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.