تركيب وأصناف السموم ووظائفها للبكتريا   B. thuringiensis

تتكون السموم من سلاسل وحلزونات طويلة من الحوامض الامينية تكون ذات طبيعة كارهة للماء وتكون امفوتيرية او ذات طبيعة كيماوية هجينة وتكون مكونة من عدة أجزاء Domains ويعتقد ان الجزء الأول بالصفات المذكورة هو المسئول عن تكوين الثقوب في أغشية الخلايا التي يصيبها، وتظهر السموم شبها بسم الخناق و Colicin A ولكن قليلة الشبه بالسم A للبكتريا Pseudomonas .

ويوجد تشابها كبيرا في الجينات المسئولة عن تكوين السموم في السلالات التي تم تحديد توالي جينوماتها. ويوجد حوالي 13 نوع من السموم البلورية الرئيسة Crystal proteins وعدد قليل او واحد له قابلية التحلل الخلوي (cyt) Cytolytic . وقد قسمت الجينات والبروتينات التي تنتجها الى أربعة مجاميع اعتمادا على التشابه في التركيب ومضايف الحشرات التي تصيبها البكتريا وهي :

الصنف الأول Class I ويكون خاصا برتبة الحشرات حرشفية الاجنحة.

الصنف الثاني Class II ويكون خاصا برتبة الحشرات ثنائية الاجنحة.

الصنف الثالث Class III ويكون خاصا برتبة الخنافس.

الصنف الرابع Class IV ويكون خاص برتبة الحشرات ثنائية الاجنحة.

ويوجد سم اضافي لبروتين بلوري يعمل على تحلل الخلايا CytA يؤثر في عدد من خلايا الفقريات واللافقريات وله وزن جزيئي 27 كيلو دالتون وهو لا يشبه الأنواع الاخرى من الناحية التركيبية .

الصنف الأول cry I

يوجد حوالي 20 جين ضمن هذا الصنف تنتج بروتينات بحدود 130 – 140 كيلو دالتون، تتجمع بشكل بلورت هرمونية اثناء عملية التبوغ. وهي سموم أولية تذوب في السائل القاعدي لأمعاء الحشرة وتحول الى سم فعال بتأثير بروتيزات امعاء الحشرة ذات الوزن الجزيئي 60 – 70 كيلو دالتون ويمكن لهذه السموم البروتينية ان تحول خارج الجسم الحي باستعمال عدد من الإنزيمات المحللة لبروتينات.

الجزء الفعال من السم يقع في النهاية الامينية للبروتين (في أغلب السموم) ويكون موقع الانفلاق بالبروتيزات ثابت لعدد من السموم مثل cryID , cryIA . وسمية البروتينات الناتجة من تحلل البروتينات البلورية تعتمد على مصدر الانزيمات المحللة للبروتينات التي تنتج التركيب السام. اما الطرف الكاربوكسيلي للسم فيكون حاويا على السستيئين ويقوم بإضفاء الثباتية على السم بتكوينه للجسور الكبريتيدية الثنائية ويضفي قابلية الذوبان غير الطبيعية لذلك يعتقد ان الطرف الكاربوكسيلي يكون مسئولا عن التركيب البلوري. وبعض البلورات يمكن ان تحوي على أكثر من سم او بروتين. وهناك عددا من السلالات تستطيع انتاج عددا من البروتينات البلورية في الوقت نفسه.

الجينات المسئولة عن تخليق السموم موجودة على بلازميد اقتراني كبير لذلك فان الجينات يمكن ان تتحرك بين السلالات المختلفة للبكتيرية. وعملية التحرك تكون نتيجة لوجود تواليات الاقحام والجينات القافزة. وقتل الحشرات يمكن ان يتم بمساعدة بعض السموم الخارجية مثل β – exotoxins وبعض مكونات البوغ القاتلة خاصة عند استعمال مستحضرات خاتم تحوي الابواغ. والسموم الخارجية الخاصة برتبة حرشفية الاجنحة يمكن ان يحصل تداخل في فعالياتها وذلك لوجود تشابه من الناحية التركيبية.

الصنف الثاني cryII

بروتينات بحدود وزن جزيئي 65 كيلو دالتون وتكون بشكل بلورات مكعبة تنتج من العديد سلالات Bt وتكون متخصصة في تأثيرها على الرتبة ثنائية الاجنحة وحرشفية الاجنحة، ويوجد منها نوعان cryII B , cryII A وهذه البروتينات تكون ذات شبه عالي من ناحية الحوامض الامينية المكونة لها الا انهما يختلفان في المضايف التي تؤثر عليها، فالنوع A يؤثر في الرتبتين المذكورة، اما B فيؤثر في حرشفية الاجنحة فقط.

الصنف الثالث cry III

سموم الصنف متخصصة في التأثير على رتبة الخناس وينتج من عدد من سلالات البكتريا، تكون السموم بشكل تراكيب بلورية معينية الشكل تحوي عادة على بروتين واحد. تنتج البروتينات بوزن جزيئي 72 كيلو دالتون ثم يحول الى وزن جزيئي 66 كيلو دالتون بتأثير بروتيز مرتبط ببوغ البكتريا ليزيل 57 من الحوامض الامينية عند النهاية الامينية من البروتين.

الصنف الرابع cryIV

تكون سامة لرتبة ثنائية الاجنحة، ويحوي الصنف على مجموعة غير متجانسة من البروتينات المتخصصة لقتل افراد الرتبة. الجينات المسئولة عنها موجودة على بلازميد كبير بحجم 72 ميكا قاعدة، وتوجد عدة جينات كل واحد يشفر لبروتين يختلف عن الاخر بالوزن الجزيئي، يحوي الصنف على عدة سموم منها A هو بروتين بوزن جزيئي 78 كيلو دالتون، و D بروتين بوزن 72 كيلو دالتون، هذه البروتينات تتجمع مع بروتين آخر بوزن جزيئي 27 كيلو دالتون وهو ناتج السم المحلل cytA لتكوين تركيب بيضوي. وتعمل السموم ضد بعض يرقات أنواع البعوض أيضاً، ويمكن للسموم ان تعمل بشكل متآزر للوصول الى افضل سمية وتتركز سمية البروتينات في الطرف الأميني من البروتين كما هو الحال مع باقي السموم.

السم المحلل cytA

وهو بروتين بوزن جزيئي 27 كيلو دالتون يؤدي الى تحلل الخلايا لعدد من الفقريات واللافقريات ومنها خلايا اللبائن.

سموم الخلايا الخضرية

مجموعة من السموم التي لها علاقة بالسموم البلورية المرافقة للبوغ تنتج من قبل عدد من السلالات أثناء النمو الخضري وتسمى VIPs ويمكن ان تتداخل مع السموم البلورية التي تنتج أثناء النمو او الطور الخضري وطور الاستقرار وأطوار التبوغ وخاصة cry 3Aa . ويمكن ان توجد جيناتها على البلازميد الذي يحمل جينات السموم البلورية ومن أهمها :

Vip 2A وتقع جيناته الى يسار Upstream جينات النوع أعلاه.

Vip 3A بروتين بوزن جزيئي 88 كيلو دالتون وينتج أثناء النمو الخضري ولا يتعرض لعمليات معالجة أثناء إفرازه، فعال ضد عدد من الحشرات من رتبة حرشفية الاجنحة، اذ يسبب شلل القناة الهضمية (Gut) ويحلل الخلايا الطلائية لأمعاء الحشرة عند تناوله، وجيناته شائعة في Bt وكذلك في B. cereus.

آلية تأثير السموم

السموم قاطبة تؤثر على الجهاز الهضمي لليرقات بشكل خاص التي تعد أكثر اطوار الحشرات ضررا. تؤدي السموم الى اضطراب الخاصية التنافذية للخلايا الطلائية في الأمعاء. واكثر البروتينات البلورية تكون بشكل سم أولي ثم تتحول الى بيبتيدات سامة بتأثير بروتيزات الامعاء مثل Chymotrypsin – like enzyme , Trypsin – like enzyme . اذ يذوب البروتين مطلقا لب السم الذي يمثل الجزء الفعال. والاختلافات في أمعاء اليرقات الحشرية تؤثر على تحول السم الأولى الى سم فعال، ويمكن اذابة السم ليصبح فعالا في الحشرات التي لا تستجيب له، ولذلك فان عملية تنشيط السم تعتمد على مصدر الانزيمات المحللة له، فبعض الانزيمات تعطي مشتقات للسم قد لا تجد لها مستلمات على سطوح الخلايا. كما ان المستلمات على سطوح الخلايا أمعاء الحشرات تختلف من نوع الى آخر وهذا يؤدي الى تخصص السم في تأثيره.

ومن مستلمات السموم هي بروتينات Amino peptidases المختلفة وكذلك Alkaline phosphatases وغيرها. ويدخل السم الى أغشية خلايا أمعاء الحشرة عن طريق الأجزاء الكارهة للماء، وهي الطرف الاميني من السم، ويدخل البروتين بشكل يشبه المظلة ثم ينفتح داخل الغشاء ليتداخل مع الأغشية الخلوية، وتشارك الأجزاء الامفوتيرية مع الأجزاء الكارهة للماء في عملية الدخول. وتتم عملية التسمم التي تلي ابتلاع اليرقة للسم بخطوات :

• اذابة البروتين البلوري في المحيط القاعدي لأمعاء الحشرة.
• هضمه لإنتاج البيبتيدات الفعالة.
• ارتباط السم الفعال الى مستلمات على سطوح خلايا الامعاء، وتكون سموم Bt ذات ألفة عالية للارتباط على مستلمات السطوح الخلوية.
• اقحام السم في الأغشية الخلوية لتكوين قنوات او ثقوب تخرج منها الأيونات والمواد الخلوية.

وعملية ارتباط السم الى الخلايا الحساسة له تكون خلال المستلمات وتكون على مرحلتين، الأولى قابلة للرجوع لذلك تستهدف عمليات تحسين Bt وسمومها ايجاد تراكيب او طفرات تنتج بروتينات ترتبط بشكل غير قابل للرجوع، وذلك لان الارتباط غير القابل للرجوع يكون مرتبطا بزيادة السمية اضافة الى زيادة الألفة الأولية للارتباط. اما المرحلة الثانية فتكون غير قابلة للرجوع وهي ناتجة من الارتباط القوي للسم واقحامه في الغشاء الخلوي وبذلك يصبح السم غير حساس للبروتيزات او التأثيرات الاخرى. بعد ذلك يقوم السم بتكوين قنوات في الأغشية ويكون قطر الثقوب معتمدا على تركيز السم، اذ ان التراكيز العالية تؤدي الى انتاج ثقوب كبيرة القطر (0.5 – 1 نانومتر) وتزيد من تسميم الخلايا. وهذه العملية تكون معتمدة على الرقم الهيدروجيني في البيئة المحيطة، فعند رقم هيدروجيني 9.5 تتكون قنوات لنقل الايونات موجبة الشحنة، اما عند رقم هيدروجيني 6 فتتكون قنوات لإخراج المركبات السالبة الشحنة وتكون القنوات بأقطار مختلفة 8 – 120 وهي في جميع الأحوال أقل قطرا من قنوات الأيونات الموجبة التي تصل الى 100 – 200 ، ويحصل انخفاض للرقم الهيدروجيني بشكل تلقائي لتحلل الخلايا. وهذا يعني ان تكون الثقوب يؤدي الى خروج الأيونات ودخول الماء وفي النهاية الى انتفاخ الخلايا وانفجارها مما يؤدي بدوره الى صوم اليرقات وانقطاعها عن التغذية ثم الموت.

ونظرا لسرعة تأثير السم فهذا يشير الى عدم الحاجة لدخول السم الى داخل الخلية لإظهار السمية. وقد وجد انه عند استعمال سم نقي على مزارع خلايا حساسة فانه يؤدي بشكل خاص الى منع نقل الحامض الاميني الهستيدين بواسطة تدرج البوتاسيوم K⁺ gradient وهي متوافقة مع الطرح أعلاه. كما ان تأثير السم يمكن ان يوقف او يؤخر بإضافة الحاميات التنافذية.

العوامل المؤثرة على سمية البروتينات

تتأثر فعاليات السموم بعدد من العوامل منها :

• عمر اليرقة.
• تغذية اليرقة.
• التغايرات الطبيعية في مجاميع الحشرات.
• نوعية وتركيبة Formulation للمستحضر المستعمل.
• الظروف البيئية.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .