عزل المسبب المرضي

يمكن احيانا التعرف على المرض النباتي من الفحص الظاهري او الميكروسكوبي او كليهما, وفي بعض الاحيان قد لا يكفي ذلك للاستلال على المرض, فقد لا يكون الكائن المصاحب لأعراض المرض هو المسبب المرضي, بل ربما يكون هذا الكائن رميا او طفيلا ثانويا, ولإثبات ان كائنا ما هو المسبب المرضي لمرض ما يجب ان نتبع فروض كوخ Koch’s postulates لأثبات ذلك وتتم كالتالي:

1. يجب ان تكون الاعراض مصحوبة بوجود طفيل.
2. يعزل الطفيل وينقى للحصول على مزرعة نقية خالية من اي تلوث.
3. يستخدم الطفيل الذي تم عزلة في اجراء العدوى لنباتات سليمة ويجب ان نحصل على نفس الاعراض التي شوهدت على النباتات المصابة طبيعيا.
4. يعاد عزل الطفيل مرة اخرى من النباتات التي اجريت لها العدوى وذلك للحصول على مزارع نقية, ويجب ان يكون الطفيل هو نفسه الذي تم عزلة في الحالة الاولى من النباتات المصابة.

والجدير بالذكر ان فروض كوخ هذه لا يصلح تطبيقها في حالة الطفيليات الاجبارية التطفل, وهنا لا ثبات المرض يجب ان تتم عدوى نباتات سليمة من نفس صنف او نوع النبات المصاب بأخذ لقاح من النبات المصاب ويجب ان نحصل على نفس الاعراض, اما في حالة الامراض المتسببة عن فيروسات فيمكن اجراء العدوى بأخذ عصير من النباتات المصابة وحقنة في النباتات السليمة, او اخذ حشرات ناقلة سبق وان تغذت على النباتات المصابة, ثم تركها لتتغذى على النباتات السليمة, وفي كل حالة يجب ان نحصل على نفس الاعراض التي كانت ظاهرة على النباتات المصابة طبيعيا.

وبالنسبة للأمراض غير الطفيلية فيجب ان نحصل على نفس اعراض المرض بتنمية نباتات سليمة تحت نفس الظروف البيئية التي تسببت في اظهار المرض كاختلاف الحرارة او الرطوبة او التهوية او نقص او زيادة العناصر او التعرض لدخان او عادم مصنع ما...الخ.

طرق العزل:

توجد عدة طرق لعزل الفطريات والبكتريا من اجزاء النبات المصابة او من التربة, وتعتمد طريقة عزل الكائن الممرض على نوع الكائن وتركيبه سواء كان في صورة ميسليوم او جراثيم كونيدية او اجسام ثمريه, بالإضافة الى الاعراض التي يحدثها على النبات نتيجة للإصابة, ومن اهم طرق عزل الكائنات الممرضة ما يلي:

العزل من الانسجة النباتية المصابة:

أ- من الاوراق:

تسبب الفطريات تبقعات على الاوراق نتيجة للإصابة واذا كان هناك جراثيم او ميسليوم على هذه التبقعات ففي الامكان نقل بعض هذه الجراثيم او الميسليوم على بيئة غذائية مناسبة, واذا كان الفطر ينمو في المزرعة فستظهر مستعمرات تتكون من ميسليوم الفطر في غضون بضعة ايام ويمكن نقلها الى مزرعة اخرى في اطباق منفصلة.

ويمكن ان تعزل الكائنات الممرضة من الاوراق بطريقة اخرى تتلخص في الخطوات الاتية:

1- تؤخذ عدة قطع صغيرة من جوانب النسيج المصاب في شكل مربعات او مقاطع مقاس 1سم2 بحيث تحتوي على انسجة مصابة واخرى سليمة.

2- توضع هذه المقاطع في وعاء به محلول مطهر مثل الكلور وكس بتركيز (10%) بشرط ان يتم غمر سطحي الورقة.

3- تنقل المقاطع بواسطة ملقط معقم من المحلول الى ورقة نشاف معقمة حتى يتم التخلص من المحلول المطهر الزائد على السطح او تغسل في ماء معقم ثلاث مرات متتالية.

4- توضع المقاطع المعقمة على بيئة مغذية بواقع 3-5 مقاطع في كل طبق زجاجي, ثم تترك الاطباق لفترة تتراوح من 3-5 ايام حتى ينمو الفطر على البيئة الغذائية ويكون مستعمرات, ثم تنقل هذه المستعمرات الى بيئات اخرى لزيادة دراسة صفات الكائن الممرض.

ب- العزل من السيقان والثمار:

يمكن استعمال الطريقة السابقة المستعملة للعزل من الاوراق في عزل الكائنات الممرضة من الاجزاء السطحية بالجذور والثمار المصابة, ولكن بالإمكان استعمال طريقة اخرى للعزل من السيقان والثمار (خاصة عندما يكون الكائن الممرض داخل الانسجة) وذلك عن طريق شق الساق طوليا او قطع الثمرة من الجانب السليم والا ثم تتجه بالقطع الى الانسجة المصابة, وعندما يشق الساق او تقطع الثمرة فان الانسجة التي يتم كشفها لم يسبق لها ان عرضت للملوثات وبالتالي فهي غير ملوثة, تؤخذ مقاطع صغيرة من الانسجة المصابة بمشرط معقم ثم تنقل مباشرة الى اطباق زجاجية تحتوي على بيئة غذائية مناسبة وتترك لتنمو لعدة ايام.

ج- العزل من الجذور, الدرنات والثمار الملامسة للتربة:

من البديهي ان تكون هذه الاجزاء النباتية ملامسة للتربة, لذلك يجب ان تغسل بالماء عدة مرات حتى يتم التخلص من التربة العالقة بها ومن الانسجة المتحللة التي توجد بها الكائنات الرمية.

اذا كانت الجذور صغيرة فأنها توضع تحت ماء الصنبور لمدة عشر دقائق, ثم يعزل الكائن الممرض منها بالطريقة التي تم وصفها عند العزل من الاوراق.

اما اذا كان العزل من جذور لحمية او درنات فتغسل هذه الاجزاء عدة مرات بالماء لإزالة التربة والانسجة المتعفنة التي تعيش عليها الكائنات الرمية, ثم تؤخذ مقاطع صغيرة سواء من الانسجة السطحية او من داخل الجذور او الدرنة وتوضع في محلول مطهر مثل هايبوكلوريت الصوديوم لمدة دقيقة او دقيقتين, بعدها تنقل هذه المقاطع بعد تجفيفها الى بيئة غذائية في الاطباق الزجاجية.

د- العزل بواسطة حقن النبات:

عندما يكون العائل متطفلا اجباريا ولا يمكن تنميته على بيئة غذائية وتكون العينة النباتية ملوثة بكائنات اخرى ولا يمكن التعرف على الكائن الممرض بالطرق العادية, فبالإمكان حقن الكائن الممرض على النبات العائل مباشرة حيث يتم التعرف على الكائن الممرض بطريقة مباشرة بعد ظهور الاعراض على النبات.

هـ- العزل من التربة:

تشكل التربة وسطا مناسبا لمعيشة العديد من الفطريات والبكتريا التي تسبب امراضا للنبات وتتواجد الفطريات في شكل جراثيم ساكنة او ميسليوم او في صور تكاثرية اخرى, وحتى يتم التعرف على هذه الكائنات لابد من عزلها وذلك باتباع طريقة مبسطة كالاتي:

1- تغربل التربة بواسطة غربال دقيق حتى يتم التخلص من الشوائب العالقة بها.

2- تؤخذ عينة من التربة وزنها 25 جرام وتنقل الى قارورة سعتها لتر ثم يضاف اليها 225 مل من الماء المعقم وتخلط التربة مع الماء جيدا, نسبة التخفيف 10:1.

3- ينقل 1ملم من المعلق بواسطة ماصة الى انبوبة تحتوي على 9مل من الماء المعقم وبذلك تحصل على تخفيف (1:100).

4- تؤخذ 1مل من المعلق الاخير (1:100) تضاف الى 9مل من الماء المعقم لنحصل على محلول مخفف بنسبة (1:1000) ويمكن الحصول على تخفيف (1:1000000) ,(1:100000), (1:10000) بتكرار هذه الخطوة.

5- ينقل مل من المحلول المعلق بتركيز 1:100 الى طبق زجاجي يحتوي على بيئة ديكستروز اجار البطاطس مضافا اليها عند تحضيرها قطرات من حامض اللبنيك ويحرك الطبق في حركة دائرية حتى يوزع المعلق على سطح البيئة, ويكرر نفس العمل بالنسبة للتخفيفات الاخرى.

6- توضع الاطباق في حضانة او في مكان درجة حرارته 24-30م لمدة خمسة ايام.

7- بعد انقضاء هذه الفترة نلاحظ نمو المستعمرات وبالإمكان فحصها والتعرف على الفطر.

تنقية المسبب المرضي

قد يظهر على البيئة –في بعض الاحيان- اكثر من كائن حي, وهنا يلزم فصل الكائن المشتبه في انه هو المسبب المرضي في حالة نقية, ويتم ذلك بطريقة ميسرة اذا كان هذا الكائن اسرع نموا من الكائنات الاخرى النامية معه, حيث يمكن قطع اطراف النموات الفطرية ونقلها الى بيئة جديدة فيسهل عزله, ويمكن في بعض الاحيان قطع طرف الهيفا تحت الميكروسكوب ونقلها الى بيئة جديدة.

اما اذا كان الكائن المشتبه فيه ابطا نموا فيمكن عن طريق نقله الى العديد من البيئات المغذية المختلفة الى ان نحصل على نمو سريع لهذا الكائن على احدى هذه البيئات مما يعمل على سهولة عزلة كما سبق, اذا لم يمكن عزل الكائن بهذه الطريقة فأننا نلجأ الى طريقة العزل من جرثومة واحدة او من طرف واحد هيفا, ويتم ذلك بعمل تخفيفات من الكائن بأخذ كمية من النمو, ثم عمل معلق مخفف منها, ثم تلقح البيئة بهذا المعلق المخفف, ثم تفحص الاطباق ميكروسكوبيا, ويتم تحديد الجزء من الطبق الذي يوجد به جرثومية واحدة ثم تنقل الى بيئة جديدة.

اما بالنسبة للبكتريا فيتم الحصول على المزارع النقية وذلك بعزل خلية واحدة فردية من مجموع البكتريا المختلطة, ويتم ذلك اما بجهاز micromanipulator او تتبع طريقة الزرع على الاطباق حيث ان ذلك يسمح للخلايا البكتيرية المتنوعة بالنمو بعيدة عن بعضها بدرجة تسمح بان تعطي كل خلية بكتيرية عند نموها مستعمرة مفردة.

وهناك العديد من الطرق للعزل من خلية واحدة وبالتالي مستعمرة واحدة, فنحصل على المزارع النقية.

1- طريقة التخطيط على الاطباق:

صورة توضح طريقة تخطيط البكتريا على الاطباق

وفيها تستخدم ابرة التلقيح ذات العقدة, حيث تعقم على اللهب, ثم يؤخذ ملء عقدة من المزرعة ثم ينتشر اللقاح على سطح البيئة المتصلبة بطبق بتري ويمكن ان يتم نشر اللقاح بالتخطيط البسيط او المتعامد او غيرها.

تترك الاطباق بالحضانة بعد كتابة البيانات اللازمة عليها, وتفحص باستمرار, بعد فترة نجد ان النمو البكتيري يتصل في بداية التلقيح ثم تتباعد المستعمرات عن بعضها بعد تخفيف اللقاح على الابرة, وهنا يمكن الحصول على المستعمرات الفردية الناتجة من نمو خلية واحدة في صورة نقية.

2- طريقة الاطباق المصبوبة:

وفيها تستخدم انابيب تحتوي على بيئة الاجار المغذي بعد ان يتم صهرها ثم تترك لتبرد وتصل حرارتها حاولي 45م تعقم الابرة ذات العقد, ثم يؤخذ ملء عقدة من المزرعة, ثم تلقح الانبوبة الاولى وترج الانبوبة بما فيها من لقاح بين راحتي اليدين حتى يتم خلط اللقاح جيدا, ثم يؤخذ ملء عقدة من هذه الانبوبة وتلقح بها الانبوبة الثانية وتكرر العملية مما يساعد على التخفيف بغد 3-4 مرات.

بعد ذلك تصب محتويات كل انبوبة من التي تم تلقيحها في طبق بتري معقم وتترك البيئة لتتصلب ثم توضع في الحضانة وبعد فترة سيظهر النمو البكتيري بشكل مستعمرات متباعدة بعضها على السطح وبعضها في داخل البيئة ويلاحظ ان الطبق الاول يحوي عددا من المستعمرات اكثر من الثاني والثاني يحوي مستعمرات اكثر من الطبق الثالث وهكذا.

تنقل مستعمرة مفردة الى طبق جديد غالبا ما تكون نقية تماما ويتم التأكد من نقئها بالفحص المجهري.

العدوى الصناعية

يتم اجراء العدوى الصناعية ببساطة بنقل جزء من الكائن الذي تم عزلة سواء هيفات او جراثيم او خلايا بكتيرية, ووضعه على او في الجزء المراد عدواه من النبات السليم.

عدوى الاجزاء الخضرية (الاوراق والفروع) للنبات, يتم بتجهيز معلق من جراثيم وهيفات الفطر وذلك بتقطيع النمو الفطري بواسطة خلاط كهربائي مع كمية من الماء المعقم ثم يرش المعلق على الاوراق او الفروع, وقد يستلزم الامر عمل تجريح بسيط للأوراق او الفروع المراد عدواها, ويتم ذلك باستخدام مسحوق الكاربورندم, اما بالنسبة لعدوى النبات بالبكتريا, فيتم تحضير المعلق من الخلايا البكتيرية ثم تلقح به النباتات المراد عدواها.

اما عدوى الثمار, فيمكن رش المعلق الفطري او البكتيري على الثمرة او عمل جرح في الثمرة ثم وضع النمو الفطري او البكتيري تحت سطح هذا الجرح.

وفي جميع الحالات يلزم توفر ظروف خاصة من الرطوبة والحرارة حتى تنجح العدوى, ولذا يجب حفظ النباتات تحت افضل الظروف الملائمة لحدوث العدوى حتى يسهل حدوث الاصابة الصناعية وتكشف المرض, وغالبا ما يتم اجراء ذلك في صوب زجاجية خاصة اوقد تحاط الاجزاء التي تم تلقيحها بأكياس بولي ايثيلين (نايلون) بمدة 12-24ساعة, ثم ترفع من على الافرع التي تم عدواها, حيث ان ذلك ييسر حدوث الاصابة.

اما عدوى التربة بغرض دراسة امراض الذبول الطري والذبول الوعائي وامراض الجذور فيتم بتلقيح التربة, اما بالفطر النامي على حبوب الشعير المنقوعة بالماء والمعقمة او تنمية الفطر على بيئة آجار دقيق الذرة ثم تقطع النموات الفطرية بالمشرط او الخلاط ثم يضاف المعلق للتربة, وتترك بعد ذلك التربة حتى يتم استيطان الفطر بها بالنسبة لدراسة امراض الذبول الطري, ثم تتم زراعة بذور النبات بها.