تعريف المسببات المرضية عن طريق استخدام التقنيات الحديثة

توجد أجهزة وتقنيات حديثة مثل طريقة PCR وجهاز Biolog لتعريف مسببات الأمراض الفطرية وتسهل الكثير من الأجهزة الحديثة من سرعة تشخيص المرض النباتي حيث أصبحت هذه الأجهزة الحديثة واسعة الانتشار.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

أحيانا لا توجد أعراض أو علامات مرضية مميزة أو كافية لمعرفة المسبب المرضي، ولهذا يلزم إحظار عينات نباتية إلى المختبر لأجراء تفاعل متسلسل متطور PCR للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة.

تعد طريقة Polymerase Chain Reaction من الطرق التطبيقية الواسعة الانتشار في مجال Molecular biology ، وتستخدم هذه الطريقة في تضخيم amplify جزيئات حامض نووي معين يتواجد بين منطقتين معروفتين من سلسلة الحامض النووي nucleotide sequence ، وغالبا ما يوجد الحامض النووي بكمية صغيرة جدا في العينة البيولوجية المركبة. تضخيم جزيئات الحامض النووي يمكن تمييزها بواسطة تجزئة حجمها بواسطة Agraose gels والتفاعل الأنزيمي والتهجين بين سلسلة الحامض النووي. والخاصية التي يعتمد عليها هذا التفاعل PCR هو استخدام حامض نووي بعد محود من النيوكليوتيدات يمثله سلسة قصير الطول من الحامض النووي تكون هذه السلسة مكونة من 2-10 نيوكليوتيد (قاعدة – سكر – فوسفات) olignucleotide primers، وهذه تحيط تماما بجزيء الحامض النووي المراد تضخيمه. وذلك يرجع إلي حساسية وتخصص هذه الطريقة PCR. وهذه الطرق لها تطبيق واسع المى للكشف عن المسببات المرضية وأيضا في تعريف المسببات المرضية وكثافتها ومتغيريها.

فوائد استخدام تفاعل PCR:

يمكن الكشف عن كميات صغير جدا من المسبب المرضي.

تطور تفاعل PCR كان سريعا حيث انه لا يحتاج إلي أجسام مضادة كما هو الحال في طريقة ELISA

اختبار PCR أكثر تطورا للكشف عن الفيروسات التي تصيب الإنسان ويستخدم هذا الاختبار أيضا للكشف عن الفيروسات النباتية والفيرويدات والفيتوبلازما لأن حساسية هذا الاختبار مفيد في الكشف عن الفيروسات المعدية التي لا يمكن الكشف عنها بالطرق السيرولوجية ولا يعتمد اختبار PCR على وجود الأنتيجين (اي مادة أذا حقنت في جسم الإنسان أو الحيوان استحثت مصل الدم (السيرم) على تكوين أجسام مضادة antibodies) (، وإنما يحتاج فقط إلي سلسلة من الحامض النووي. وفي وجود معلومات متاحة من molecular genetics لمسببات مرضية أخرى يتوقع أن اختبار PCR يصبح ذات أهمية كبير في التشخيص.

والعديد من العناصر يتطلبها اختبار PCR وتشمل الاتي:

Thermal stable polymerase

هناك العديد من الأنواع المتوفر على النطاق التجار وتختلف في مميزاتها من حيث فعاليتها ودقتها.

إنزيم البلمرة أو مبلمر DNA)) وهو إنزيم يحفز تكوين جزيئات DNA من وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات ( dATP-dGTP-dCTP-dTTP ) ويعرف هذا الأنزيم أيضا باسم DNA nucleotidyltransferase حيث يحفز مضاعفة DNA في مرحلة الانقسام الخلوي باستخدام وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات ( dATP-dGTP-dCTP-dTTP ) ويحتاج التفاعل إلى ايونات الماغنسيوم وقالب DNA ويقصد به أحد الضفرتين حلزون DNA المسمى بالفرع النشط الذي تستخدمه الخلية في نسخ التسلسل النيوكليوتيدي الموجود عليه ونقله إلى جزئ من DNA.

بعض المصطلحات الهامة:

Primers (مبدئ أوفتيل):

ويقصد به أي ماد يحتاج إليها تفاعل البلمرة ، وتستخدم المبتدئات في عمليات البناء الحيوي DNA والبروتينات في أنبوب اختبار in vitro. حيث يتطلب Olignucleotides )حمض نووي بعدد محدود من النيوكليوتيدات يمثله سلسلة قصيرة الطول تتكون عادة من 2-10 وحدات نيوكليوتيد (قاعدة - سكر – فوسفات) لأنزيم البلمرة polymerase وذلك لبدأ تخليق أو تركيب DNA، Olignucleotides تعرف أيضا باسم Oligos أو باسم Primers، ويتم تصميم Primers لتثبيت طرف سلسلة DNA ومضاعفته أو تضخيمه amplified)).

dNTP:

PCR القياسي يحتوي على كميات متساوية من وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات (dATP-dGTP-dCTP-dTTP) التي تكون سلسلة من الحامض النووي. إنزيم البلمرة أو مبلمر  DNA (DNA polymerase Taq) يستخدم وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات لتخليق سلسلة جديد من الحامض النووي أثناء اختبار PCR.

Divalent Cations )جزئ يحمل شحنة موجبة(:

جزئ يحمل شحنة موجبة )الكاتيون هو أيون موجب يحمل شحنة كهربائية موجبة)، والعديد من انزيمات بلمرة DNA تحتاج إلي جزئ من الكاتيونات لنشاطها وتركيز الكاتيونات يؤثر على فعالية PCR، عادة يستخدم الماغنسيوم Mg⁺² في اختبار PCR، و dNTP والمبدئ (الفتيل – Primers ) يرتبط أيضا بالماغنسيوم Mg⁺² ويجب أن يكون تركيز الماغنسيوم متوفر حيث يحتاج التفاعل إلى أيونات الماغنسيوم اللازمة لأنزيم بلمرة ( DNA polymerase) DNA. وعادة ما يكون التركيز المستخدم من الماغنسيوم Mg⁺² هوmM 1.5 وربما قد يتم تغيير التركيز في حالة عدم نجاح اختبار PCR .

منظم الحموضة (Buffer):

ويقصد به محلول يحتوي على حمض وقاعد أو ملح يعمل على حفظ تركيز ثابت من ايون الهيدروجين فهي ماد تذاب في المحلول تقاوم التغيرات المفاجئة في الرقم الهيدروجيني PH حيث أن الأنزيمات التي تحفز سير التفاعلات تعمل في مدى صغير من هذا الرقم. كل الأنزيمات لها رقم هيدروجيني أمثل عند هذا الرقم تكون فعالة. وعادة ما يستخدم في اختبار PCR محلول بفرmM10 TRIS-HCL عند رقم هيدروجيني PH= 8.3-8.8 عند درجة حرارة الغرفة، وعند تحضين PCR عند درجة حرارة 72م والتي عندها يعمل Taq DNA polymerase على تضاعف سلسة الحامض النووي ، ينخفض الرقم الهيدروجيني إلي حوالي 2و7 PH= 7.2)).

قالب Template DNA:

وهو ضفير أو جديلة واحدة من ضفرتين الحلزون المزدوج يستخدم في عملية مضاعفة DNA ، ويقصد به احد ضفيرتي حلزون DNA المسمى بالفرع النشط الذي تستخدمه الخلية في نسخ التسلسل النيوكليوتيد. وقالب DNA أما أن يكون مكون من ضفيرة واحدة Single stranded أو من double stranded (من

ضفرتين من النيوكليوتيدات العديد لتكون ما يعرف بالحلزون المزدوج وبكل لفة حلزونية عشر ازواج من القواعد النتروجينية والضفرتين لا يتشابهان في التركيب ولا في تعاقب القواعد النتروجينية، فاذا وجد الأدينين ( A ) في احد الضفرتين يقابله دائما الثيمين ( T ) في الضفيرة الأخرى وبالمثل الجوانين ( G ) يقابله السيتوسين ( C). ومن الممكن أيضا عزل هذا القالب من الكائنات الحية مثل النبات أو البكتيريا، اختبار PCR يمكن نسخ العديد من DNA من السلسة المفردة ولكن العديد من الآلاف النسخ من DNA تضاف تفاعل الخليط.

The Polymerase Chain Reaction:

يتكون PCR من ثلاث خطوات عامة تكرر 30مرة ، وبعد كل دورة من الثلاث خطوات فان كمية المصنعة من DNA في التفاعل المزدوج حتي تستخدم عناصر التفاعل. تستخدم (الجهاز) الآلة المصنعة لدورة الحرارية لتسخين وتبريدPCR  إثناء تكرار هذه الخطوات.

1- الخطو الأولي: Denaturation

الخطوة الأولي هي تسخين DNA على درجة حرار 95م ليتم فصل الضفرتين أو الحلزون المزدوج (dsDNA) إلي ضفيرة مفردة  Single (strands) وعامة هذه الخطوة الحاسمة تأخذ من 30-60 ثانية.

2- الخطوة الثانية Annealing:

الخطوة الثانية هي تبريد التفاعل حيث يرتبط انزيم البلمرة بقالب الحامض النووي ويعتمد ذلك على كيفية تبريد التفاعل لحدوث الارتباط وتعرف درجة الحرار هذه باسم Melting والعديد من الباحثين يستخدموا معادلات مختلفة لتقدير درجة الحرارة ، حيث انه من الأهمية معرفة ذلك وعامة تكون درجة الحرار المستخدمة تتراوح من 45-60 درجة مئوية.

3- الخطوة الثالثة: Extension

وتجري الخطوة الثالثة لتثبيت الحراري لنزيم البلمرة DNA polymerase(Taq) وذلك لتمديد سلسة الحامض النووي من إنزيم البلمرة عن طريق إضافة dNTPs لعمل سلسة جديد من DNA ، والوقت اللازم للتمديد يعتمد على سرعة تفاعل إنزيم البلمرة وطول الحامض النووي المختبر. وعادة ما تكون درجة الحرار المستخدمة 72م وأحيانا تكون أقل من ذلك.

وعادة ما يكون برنامج PCR يحدث تضاعف 1500 من نيوكليوتيدات لجزيء الحامض النووي في هذه الدور الحرارية.

94درجة مئوية لمد 30 ثانية

55 درجة مئوية لمد 45 ثانية

72 درجة مئوية لمد 90 ثانية

وهذه الخطوات الثلاثة يتم تكررها 30 مرة.

كل زمن من الدورة يكرر والكمية من الحامض النووي المزدوج يتم استنساخه عندما تكتمل عناصر التفاعل ولذلك فانه:

الدور الأولي     2نسخة

دورتين           4نسخ

ثلا دورات       8 نسخ

أربع دورات    16 نسخة

عشر دورات   1024 نسخة

عشرين دور أكثر من 1.000.000 نسخة

Polymerase Chain Reaction (PCR).

زيادة جزيئات الحامض النووي DNA باستخدام polymerase chain reaction يتم إجرائه عن طريق دورة حرارية DNA Thermal Cycler أو

Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler 9600 عن طريق إضافة كواشف التالية في أنبوب الطرد المركز سعة 2 و 0 مل أو 5 و 1 مل: كمية صغير من جزئ الحامض النووي cosmid, plasmid, or genomic DNA) DNA ), وتشمل الطريقة 25-30 دورة عند 3 درجات حرارة: درجة حرارة قياسية 95درجة مئوية، 55 درجة حرار مئوية، 72 درجة مئوية لمد 30 ثانية، 30 ثانية، 60 ثانية DNA Thermal Cycler ولمدة 60 ثانية Thermal Cycler 9600 وليتم التفاعل في الدورة الحرارية DNA ، يتم خليط التفاعل عدن طريق إضافة نقطتين من الزيت المعدني قبل الدور الحرارية لمنع تبخر وتكثيف السائل، وهذه الخطوة غير ضرورية لدورة الحرارية Thermal Cycler 9600 (عند درجة حرارة 100مئوية) حيث تكون مزودة بغطاء حراري (غطاء الأنبوب الذي يحتو على العينة) لمنع تبخر وتكثف السائل. وبعد إجراء التفاعل PCR يوضع الخليط في اجاروز جل أو electrophoresed للكشف عن نواتج التفاعل، في بعض الأحيان نجد إن الناتج من PCR المفرد غير كاف. ويتم الترسيب بواسطة الكحول الأثيلي في الدور الثانية لزياد PCR.

المصدر

يونس يوسف مولان و صلاح الدين الحسيني محمد و ياسر عيد إبراهيم (2008) تشخيص الأمراض الفطرية وطرق مكافحتها.