مكونات الدالات المستعملة لفحص البيئة

يتبين ان المؤشر الوراثي او تسجيل الحوامض النووية لا يمكن ان يعد ملائما للتعامل مع البيئة، ولذلك تم استعمال مقاييس اخرى للتغلب على المعوقات ومنها استخدام الدهون الفوسفاتية في الأغشية الخلوية.

استعمال الدهون الفوسفاتية في الأغشية الحيوية

تعد الحوامض الدهنية من المكونات الأساسية للأغشية الخلوية في الخلايا الحية، وتتكون الدهون الفوسفاتية (PLFAs) Phospholipid fatty acids من جزيئة واحدة من الكليسرول (3 ذرات كاربون) وتكون مجموعتين من OH من جزيئة الكليسرول متصلة بسلسلتين من الحوامض الدهنية والتي تمثل الجزء الكاره للماء، ومجموعة الاخرى من OH الكليسرول تتصل بمجموعة الفوسفات وهي الجزء المحب للماء، لذلك تكون الدهون غير متناظرة لأنها مكونة من جزء محب للماء وآخر كاره للماء، وتتجمع هذه الدهون بشكل طبقتين يكون الجزء المحب للماء الى الخارج والكاره للماء مدفون في الداخل كما موضح في الشكل (1)

شكل 1 : التركيب الاساسي لتجمع الدهون في الأغشية الخلوية

وتقسم الدهون الفوسفاتية الى عدة مجاميع كما هو موضح في المخطط الشكل (2)

شكل 2 : تقسيم الحوامض الدهنية الموجودة في الاحياء المجهرية

الاختصارات :

PLFA : Phospholipid fatty acid , EL- PLFA : Ester – linked phospholipid fatty acid , NEL – PLFA : Non - ester – linked phospholipid fatty acid , EL – UNFA : Ester – linked substituted fatty acid , EL – HYFA : Ester – linked hydroxyl substituted fatty acid , NEL – UNFA : Non - ester – linked unsaturated . NEL – HYFA : Non - ester – linked hydroxyl substituted fatty acid , EL – SATFA : Ester – linked saturated fatty acid , EL – MUFA : Ester– linked monosaturated fatty acid , EL – PUFA : Ester – linked polysaturated fatty acid , STRA : Straight chain fatty acid , BRANC : Branched chain fatty acid

وتوجد المجموعة NEL – HYFA في البكتريا السالبة لصبغة كرام في الجزء LPS في الغشاء الخارجي وتسمى او تمثل LPS – HYFA السموم الداخلية وتستعمل الحوامض الدهنية كواسمات حيوية Biomarkers في الدراسات البيئية كما موضح في الجدول (1)

جدول 1 : بعض الواسمات الحيوية من الحوامض الدهنية الموجودة في مجاميع مختلفة من الاحياء المجهرية

وبالرغم من ان PLFAs تكون ذات تراكيب مختلفة ولها وظائف متخصصة الا ان بعض الحوامض الدهنية يمكن ان توجد في أكثر من مجموعة منها :

•        الحوامض الدهنية المتفرعة وتعد واسمة حيوية للبكتريا الموجبة لصبغة كرام ولكنها يمكن ان توجد في البكتريا السالبة لصبغة كرام اللاهوائية المختزلة للكبريت وأنواع من Cytophaga و Flavobacterium .

•        الحوامض الدهنية الحلقية Cyclopropyl توجد في البكتريا السالبة لصبغة كرام ولكنها توجد في بعض البكتريا الموجبة لصبغة كرام اللاهوائية.

•        LPS – HYFAs تكون علامة مميزة للبكتريا السالبة لصبغة كرام ولكن لوحظ وجودها في بعض الفطريات.

•        الحامض الدهني 6ω218: يعد دليلا للفطريات، ويوجد بشكل كبير في النباتات ولكنه يعد دليلا قويا على وجد الفطريات عند غياب النباتات.

أهمية تحليل ALFAs

ان تحليل نماذج التربة بالنسبة لهذه المواد يعطي فكرة عن المحتوى الكمي للميكروبات الحية النشطة وكذلك الكتلة الميكروبية وذلك لعدة أسباب :

•        الدهون الفوسفاتية تتحلل بسرعة بعد موت الخلايا، كما انها لا توجد في المواد المخزونة في الخلايا.

•        لها علاقة وثيقة مع المؤشرات الاخرى المستعملة لتحديد الكتلة الحيوية للميكروبات مثل استعمال Acridine orange.

•        لها علاقة وثيقة مع محتوى الخلايا من ATP.

وتمتلك هذه المركبات العديد من الصفات مما يجعلها تفرض نفسها للاستعمال كدلائل حيوية للاجهادات البيئية وذلك لأن :

•        هي مركبات أساسية في الأغشية الخلوية للميكروبات وتساعد الاحياء في الاستجابة للظروف الخارجية والداخلية.

•        تغيير نوعية المجتمع الميكروبي في النظام البيئي يؤدي الى تغيير PLFAs.

لذلك يمكن ان تستعمل لتسجيل التغيرات والاجهادات البيئية.

ومن المؤشرات المستعملة بالنسبة للـ PLFAs هو تغير نسب النظير Cis الى Trans في الحوامض الدهنية الحاوية على آصرة مزدوجة واحدة Monounsaturated عند تسليط الاجهادات، ووجود الحوامض Polyunsaturated يكون نادرا في البكتريا ولكن بعض بكتريا الكرش Rumen Bacteria تستطيع انتاج النظير Trans من هدرجة Polyunsaturated الخارجية المنشأ مثل هدرجة  (18:2ω6,9) Linoleicاو  Linolenic (18:3ω3,6,9) لتكوين 18:1ω7t .

ومن المعروف ان أكثر الاجهادات البيئية تؤدي الى تغيير ميوعة الأغشية وزيادة الميوعة تؤدي الى تكوين تراكيب غشائية غير مزدوجة الطبقة ويؤدي بدوره الى حصول نضوحيه غير متخصصة تؤثر على أنظمة النقل اذ تقوم بتثبيطها او زيادة فعاليتها. وعليه ولأجل ان تواجه الخلايا هذه الاجهادات لابد من تغيير مكونات PLFAs لغرض مواجهة ميوعة الأغشية والتي تعد احد آليات التطبع. ومن التغيرات هو حصول المزامرة، اي تحول الوضع من Cis الى Trans مثل تحول 18:1ω7c الى  18:1ω7t وتحول 16:1ω7c الى  16:1ω7tوبذا يتكون النظير Trans من النظير Cis المقابل له بدون ان يحصل تغيير في موقع الآصرة المزدوجة وهو ما يطلق عليه معامل الاجهاد الدهني Stress lipid index والتغيرات موضحة في الشكل (3).

شكل 3 : مزامرة الحوامض الدهنية الحاوية على اصرة مزدوجة واحدة من دهون اغشية الاحياء المجهرية

وانظرا للاختلاف في التوزيع الفراغي للمركبات فان Trans يقلل من ميوعة الأغشية ويضاد الاجهاد. ان التزامر يحدث فقط عند تغير ميوعة الأغشية ولا يحدث عند ظروف تمنع نمو الكائنات. وتتغير نسب Cis الى Trans عند ارتفاع درجات الحرارة ووجود المواد الكيماوية العضوية السامة والجوع، وزيادة الضغط التنافذي، وانخفاض الرقم الهيدروجيني ووجود المعادن الثقيلة السامة.

وتسبب الحرارة العالية زيادة نسبة Trans الى Cis للحوامض الحاوية على آصرة مزدوجة واحدة من 0.1 الى 0.4 عند ارتفاع درجة الحرارة من 25 الى 45 م◦ في مزارع نقية للبكتريا Ps. Putida اما عند تسخين نماذج التربة والدبال الى 160 م◦ فقد وجد ان النسبة للحامض الدهني  16:1ω7تزداد من 0.12 الى 0.21 ، وهناك علاقة خطية بين انخفاض النظير Cis للحوامض الدهنية  16:1ω7 و 18:1ω7 بارتفاع درجة الحرارة.

وتؤدي المركبات العضوية السامة وزيادة الضغط التنافذي الى زيادة النظير Trans في دهون البكتريا التي تعد نموذجا دراسيا لمثل هذه الاغراض وهي Ps. Putida .

كما ان اجهاد الجوع يؤدي أيضاً الى زيادة النظير Ps. Putida الى Cis عند انخفاض الرقم الهيدروجيني سواء في المزارع النقية للاحياء او في الدراسات الحقلية، وتحدث زيادة مماثلة عند زيادة تراكيز المعادن الثقيلة ووصولها الى مستويات سامة ويمكن اجمال التأثيرات المذكورة في الجدول الآتي (جدول 2)

جدول 2 : تأثير الظروف المختلفة على نسب النظير trans الى cis في الحوامض الدهنية غير المشبعة

ويبدو ان المعادن الثقيلة والتي توجد في العديد من البيئات الملوثة تتداخل مع بروتينات الأغشية للخلايا الميكروبية مؤدية الى اضطراب توزيعها الفراغي ثم اضطراب وظائفها، لذلك تلجأ الخلايا الى زيادة النظير Trans لأنه يمثل الوضع الأكثر ثباتا مقارنة بالوضع Cis.

اما الحوامض الدهنية الحلقية Cyclopropyl fatty acids مثل Cy19: 0 , Cy17 : 0 فتزداد نسبتها بشكل مرافق لزيادة النظير Trans على حساب النظير Cis تحت أكثر ظروف الاجهاد المذكور اعلاه، اضافة الى حصول الزيادة عند استعمال المبيدات والاجهادات الميكانيكية المتمثلة بحراثة التربة كما موضح في الجدول (3).

جدول 3 : تغير الحوامض الدهنية الحلقية تحت ظروف الاجهاد

ويتكون المركب الحلقي من اضافة مجموعة مثيل CH₃ الى النظير Cis وهذا يحدث طبيعي عند دخول الخلايا الى طور الاستقرار من أطوار النمو والذي يمثل احد مظاهر الاجهادات على الخلايا عند زيادة الزحام وقلة المواد الغذائية وزيادة الفضلات وغيرها من الظروف التي تمت مناقشتها سابقا. فتحول النظير Cis الى الشكل الحلقي يعني ان الخلايا لا تستطيع استهلاكه، كما ان وجوده يضفي الثباتية على الأغشية الخلوية وذلك بتقليل ميوعة الأغشية وعدم تفككها، اضافة الى ان تحول آصرة النظير Cis المزدوجة الى الشكل الحلقي يقيد الحركة ويقلل من حدوث التفاعلات المؤكسدة التي يمكن ان تحث تحت ظروف الاجهاد.

PLFAs الفطرية

تلعب الفطريات أدوارا مهمة في الانظمة البيئية بفعالياتها المتعددة ومشاركتها في الحفاظ على جودة التربة والمساعدة على تكتل وتجمع حبيبات التربة، وتزيد من المواد الغذائية بإطلاقها للإنزيمات لتفكيك بقايا النباتات. وهناك علاقة واضحة بين اضطراب التركيب الفيزياوي للتربة مع الواسمات الحيوية الفطرية كما يلاحظ عند الرعي وحراثة الترب وحرقها، اذ تؤدي هذه المعاملات الى نقصان النسبة المئوية للحامض الدهني المميز لها 18 : 2ω6 بنسب تتراوح بين 48 – 15%  ، ويمكن عزو ذلك الى ان الخيوط الفطرية تكون حساسة للاضطرابات الفيزياوية أكثر من الاحياء وحيدات الخلايا، وعليه يكون من الافضل استعمال الاحياء وحيدات الخلايا كدالات في البيئة أكثر من الفطريات. ويكون المؤشر الفطري حساس أيضاً لوجود المواد الكيماوية مثل المعادن الثقيلة والمبيدات ولكنها من نواحي مختلفة تأتي بالدرجة الثانية بالنسبة لوحيدات الخلايا.

ويمكن استعمال المحتوى الدهني لقياس مؤشرات اضطراب اخرى مثل استعمال المبيدات ووجود المعادن الثقيلة بتراكيز عالية سامة فتحت مثل هذه الظروف تزداد PLFAs الخاصة بالبكتريا السالبة لصبغة كرام وتقل تلك الخاصة بالبكتريا الموجبة لصبغة كرام، وهذا يعود الى زيادة وجود الحوامض الدهنية الحلقية في السالبة وكذلك وجود طبقات الغشاء الخارجي الذي يكثر فيه LPS والتي تساعدها في مواجهة الاجهادات الخارجية بشكل أفضل فمن المعروف بشكل عام ان البكتريا السالبة لصبغة كرام تسود البيئات الملوثة بالمعادن مقارنة بالبكتريا الموجبة لصبغة كرام.

ويفيد تسجيل المحتوى الدهني في تحديد سبات الاحياء أيضاً فمثلا البكتريا V. cholera تستطيع العيش في ظروف المجاعة في المختبر لعدة اشهر بتكوينها خلايا صغيرة جدا يصل حجمها الى 0.2 – 0.4 مايكرومتر بحيث تكون قابلة للترشيح بالمرشحات المستعملة للتعقيم وتستطيع الرجوع الى الحالة الطبيعي بعد ساعتين من تزويدها بالمواد الغذائية. وتجد أنواع عديدة من Vibrio في المياه الساحلية بشكل صغير، وتكون هذه الخلايا القزمة ظاهرة شائعة عند المجاعة في البيئات المائية، ويتغير نسق الحوامض الدهنية عند المجاعة في العديد من البكتريا لذلك يمكن تسجيل معامل الاجهاد Stress index لتحديد وضع البيئة الغذائي، اذ تحصل زيادة في الحوامض غير المشبعة خاصة 16 : 1 ونقصان في الحوامض الدهنية المشبعة خاصة في الأيام الأولى من المجاعة وتحت درجات حرارية منخفضة كما في البيئات البحرية.

معوقات استعمال PLFAs

بالرغم من ان الدهون الفوسفاتية يمكن قياسها كما ونوعا الا ان الاستعمال الطلق يواجه بعض المعوقات، وذلك لأنها لا تعطي معلومات على مستوى النوع للأحياء مثل الاركيا او البكتريا اذ لا يمكن ان تحدد بهذه الطريقة. كما ان القواعد المعلوماتية الموجودة مبنية على معلومات لأحياء نقية المزارع، ولكن عند توسيع قواعد المعلومات يمكن ان تزيد أهمية هذه الواسمات الحيوية. وقد تم البدء بوضع Biochemical libraries لتشخيص الاحياء المعزولة من البيئة ومعرفة وضع البيئة. ومن المعوقات الاخرى ان تحديد PLFAs هي طريقة غير متخصصة لأنها لا تعطي الانواع الحقيقية ولكن تعطي صورة عامة عن المجاميع المكونة للمجتمعات الموجودة في البيئة.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .