تقنية التفاعل البنائي التتابعي Polymerase Chain Reaction (PCR)

تحفظ المعلومات الوراثية وغيرها داخل الحمض النووي DNA. وتقوم الخلية بمضاعفة كمية الحمض النووي وقت انقسام الخلية بشكل تلقائي وبشكل سريع مع وجود نظام تصحيح للأخطاء خلال النسخ. وتبلغ سرعة النسخ والمضاعفة  الى 1000 قاعدة نيتروجينية بالثانية (داخل النظام الحيوي). ومع التطور في مجال التكنولوجيا الحيوية والذي يقوم على التعامل مع الحمض النووي DNA بشكل اساسي، استدعى ذلك العلماء الى ان يبحثوا عن طريقة او تقنية تقوم على مضاعفة كمية الحمض النووي DNA بشكل كبير، فكان هنا عدة محاولات لتحفيز الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو Growth Factors، ولكن لم تكن هذه الطريقة ذات جدوى لدى العلماء لأسباب كثيرة، الى ان قام العالم Dr Kerry Mullis في عام 1985 والحاصل على جائزه نوبل في الكيمياء عام 1993 بنشر اختراعه لتقنية PCR فكانت هذه التقنية البوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية، من اهم الاسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار هو عدم اعتمادها على النظام الحيوي (أي الخلية) والتحكم بكمية الحمض النووي DNA والسرعة في الانتاج، ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام اصلاح عند حدوث أي ارتباط خاطئ Miss match.

تعريف تقنية التفاعل البنائي التتابعي؟

هي تقنية عملية تقوم على اكثار نسخ الحمض النووي DNA خارج النظام الحيوي. أي انها طريق لنسخ الحمض النووي معمليا ولك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة من محددة من الحمض النووي ومضاعفة انتاجها لكي يتسنى اجراء اختبارات وفحوصات اضافية.

متطلبات تقنية التفاعل البنائي التتابعي PCR of Technology Requirements

يتطلب امر انتاج الحمض النووي DNA بواسطة PCR توفير الاحتياجات الاتية:

1. جهاز للتحكم في درجات حرارة التفاعل بشكل دقيق ومتتالي (الدورة الحرارية Thermo cycle) حيث يقوم هذا الجهاز بتغيير درجة الحرارة بشكل سريع، لان تغيير درجة الحرارة هو الاساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية.
2. انزيم DNA polymerase لبناء ترتيب القواعد النيتروجينية (وحدات الحمض النووي DNA)، ويجب ان يكون هذا الانزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل، على اية حال، يعد Tag Polymerase من الانزيمات المقاوم للحرارة العالية.
3. وجود مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية : (T – C – G-A) ليتمكن الانزيم من ترتيبها في مواقعها اثناء عملية نسخ الحمض النووي DNA .
4. وجود بادئ Primer وهو عبارة عن قطعة صغيرة من الحمض النووي DNA ليتمكن الانزيم من بدء البناء والنسخ عليها.
5. وجود نسخة من الحمض النووي DNA المراد نسخه.
6. وجود محلول او سط ليتم به التفاعل وهذا المحلول يختلف من تفاعل واخر. ويوضح شكل (1) متطلبات تقنية التفاعل البنائي التتابعي.

 شكل 1 : متطلبات تقنية التفاعل البنائي التتابعي (PCR) 

عملية النسخ Replication Technique

بعد وضع الحمض النووي المراد نسخه مع البادئ وانزيم البوليمريز ومجموعة من الاحماض النووية من انبوب داخل جهاز التحكم الحراري فان عملية النسخ تمر بثلاث مراحل منفصلة (أشكال 1 – 2 – 3) :

1. مرحلة التفكيك او الدنترة Denature : وتتم برفع درجة الحرارة الى 95 م وذلك لفك الحمض النووي DNA الاصلي.
2. مرحلة الالتصاق او الالتحام anneal : وتتم بخفض درجة الحرارة الى ما بين 55-60 م ليقوم البادئ بالالتصاق فيزيائياً بواسطة الروابط الهيدروجينية مع الحمض النووي DNA الأصلي.
3. مرحلة التمدد extend : وتتم برفع درجة الحرارة الى 75م ليقوم انزيم البوليمريز بعمله في بناء الحمض النووي DNA الجديد.

وهذه المراحل الثالث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي

اشكال 1-2 : الدورات الحرارية ومراحل التفاعل التسلسلي في تقنية PCR

DNA الاصلي قد تضاعف، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي على عدد الدورات التي يتم انجازها.

واذا اخذنا في الاعتبار عدد دورات PCR وعدد النسخ الناشئة، يمكن ايجازها في الجدول الاتي

وإذا اخذنا في الاعتبار درجات الحرارة والمراحل الحرارية المختلفة لهذه التقنية يمكن الوصول الى شكل (3) الاتي :

شكل 3 : الدورات الحرارية ومراحل التفاعل التسلسلي في تقنية PCR

استخدامات تقنية التفاعل البنائي التتابعي Applications of PCR

لتقنية PCR استخدامات عديدة في مجال ابحاث الحمض النووي والوراثة ومنها:

• الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بادئ (بريمر) خاص للطفرة لا كثار الجين الخاص بها، ومنه نقوم بمعرفة المرض اذا كان على زوجي الكروموسومات او على احداهما (أليل allele).
• تحديد البصمة الوراثية.
• الكشف عن الفيروسات وهي الوسيلة الادق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
• اكثار الجين المراد ادخاله على البلازميد او الحمض النووي DNA المضيف وهو العنصر الاهم في عملية التجميع الجيني Recombinant DNA.
• تغيير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع انزيمات القطع Restriction enzymes
• تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي DNA Sequencer.
• معرفة طول الحمض النووي DNA.
• تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات.
• يستخدم في تقنية Microarrays.
• في مشروع الخريطة الجينية Genome map.
• الساوثرن بلوت Southern plot أو تهجين الاحماض النووية.
• تقنية ارتباط الحمض النووي DNA بالبروتين DNA-Protein Interaction
• في مجال الطب الشرعي (اختبار الابوة، حالات الاغتصاب، تحديد الهوية.. إلخ) وغيرها من الاستخدامات المعملية البحثية.

أنواع تقنية التفاعل البنائي التتابعي Types of PCR

هناك نوعان من التفاعل البنائي التتابعي يمكن ايجازها في الاتي :

• التفاعل البنائي التتابعي العادي وهو ما تم سرده والتطرق اليه في الخطوات السابقة Normal PCR
• التفاعل البنائي التتابعي باستخدام الكمبيوتر Computerized Real Time PCR

وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد هو ربط جهاز PCR بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي DNA. ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية حرة مشعة لتحديد ذلك، مما يسهل على الباحثين تقدير الوقت لتحديد مدى وجود الجين المطلوب من عدمه، وكمية الجين بدون الوصول الى نهاية

شكل 4 : جهاز Real Time PCR المستخدم في تفاعل PCR

الدورات الحرارية المحددة (شكل 4 – 5).

شكل 5 : نواتج التفاعل البنائي المتسلسل

المصادر:

عبيده ، علي ابراهيم علي و محمود ، احمد عبد الفتاح .اساسيات التقنية الحيوية . كلية الزراعة جامعة الاسكندرية .