اصابة النباتات بالنباتات الطفيلية ومقاومة الاصابة

Infection and Resistance

في عدد من النباتات الطفيلية ثمة تبادل إشاري بين النبات الطفيلي وجذور عائله يمكن أن تسهم في تطور الإصابة التي تمر بمراحل متتابعة (شكل 1 إلى 3).

شكل1 : تبادل الجزيئات الإشارية بين النبات الطفيلي والعائل حيث تميز 5 مراحل هي إنبات البذور والبحث عن محفزات تكوين الممصات أو استخلاصها من الجذور وتحفيز تكوين الممصات واختراق الممصات للجذر وعناصر الخشب (الخطوط المنقطعة) وتعزيز الاتصال بالجذر. السهام تشير إلى اتجاه حركة الجزيئات الإشارية بين النبات الطفيلي على اليمين والنبات لعائل على اليسار

عن : (1998 ,Estabrook & Yoder)

شكل 2 : تحفيز تكوين الممص في جذور النبات الطفيلي a) Triphyxaria versicolor) - تحفيز جذور النبات الطفيلي بواسطة HIFS من ناضح جذور نبات الخردل النموذجي Arabidopsis الصورة هي مقطع طولي في الجذر بعد 48 ساعة من استخدام المحفزات. يظهر المقطع التمدد القطري لخلايا القشرة مع انقسام بعض الخلايا. (b) - صورة بالمجهر المجسم لجذور T. versicolor معاملة بـ 10 مكرولتر من DMBQ وغير معاملة بمثبتات. الانتفاخ وتجمع الشعيرات الكثيف هي ما يميز الممص قبيل الاتصال بجذر العائل

عن: (Estabrook & Yoder, 1998)

إنبات البذور (Seed Germination)

شكل 3 : الإشارات المستخدمة في تأثرات الطفيلي - النبات العائل. أمثلة لإشارات الإنبات والممصات معروضة بصيغها التركيبية. المركبات الفعالة تحفز تكوين الممصات بينما المركبات غير الفعالة لا تحفزها، أما المثبطات فتخفض نشاط HIF لمركب DMBQ.

<(5)Formononetin (4) Xenognosin B (3)Xenognosin A (2) Resorcinol (1)SXSg (9)Benzoquinone (8)Tetrafluorbenzoquinone (7)DMBQ (6) Ferulic acid (12)Zeatin, (11)CPBQ <(10)Dihydroquinone

عن : (1998 ,Estabrook & Yoder)

معظم بذور النباتات الطفيلية تنبت مباشرة متى ما توفرت الظروف البيئية المناسبة من الرطوبة والأوكسجين ودرجة الحرارة والضوء المناسبة، لكن إنبات بذور بعض النباتات الطفيلية مثل أنواع Striga و Alectra و Orobanche تعتمد على عوامل تفرز أو تشتق من العائل. حظيت المواد المحفزة والمثبطة لإنبات بذور النباتات الطفيلية بدراسات عديدة في محاولة لتحديدها مساهمة في فهم آلية الإصابة والاستفادة من تطبيقاتها العملية في السيطرة عليها.

أول عامل محفز لإنبات بذور Striga من عائل طبيعي كان المركب SXSg وهو هيدروكينون يؤكسد ذاتيا إلى الكينون Sorgoleone غير الفعال.

ومع أن النباتات الطفيلية المعتمدة على عوامل إنبات البذور تتحدد خصوصيتها في الغالب على المواد المحفزة المنتجة من جذور العائل إلا أن ذلك لوحده لا يفسر كل المسألة فأول محفز لإنبات البذور تم اكتشافه من جذور نبات غير عائل هو القطن.

تحفيز تكوين الممصات وتطور البادرة قبل الاتصال

Haustorium Induction and

Preattachment Development

الممص (Haustorium) هو عبارة عن تركيب مدور منتفخ يتصل بسطح العائل وهو عضو متعدد الوظائف يخترق العائل ليؤمن صلة مباشرة بخشب النبات العائل موجها الماء والعناصر المغذية باتجاه واحد نحو الطفيلي في النباتات الطفيلية من انواع عائلة Scrophulariaceae ينشأ الممص نتيجة لتغيرات في نمو وتكشف خلايا خاصة في الجذر استجابة لمحفزات خارجية.

إن ملاحظة حاجة النبات الطفيلي إلى وجود النبات العائل من اجل تكوين الممصات تؤشر إلى وجود عوامل خارجية تحفز تكوينها. أول عوامل محفزة لتكوين الممصات مشتقة من العائل ((Host Induced Factors (HIFs) تم استخلاصها من اوراق نبات Astragalus gummifer بعد ذلك استخلص DMBQ من جذور الذرة البيضاء (السرجوم) والعديد من المركبات المرتبطة بها تركيبيا، الاستجابة لهذه

المركبات تكون سريعة، فخلال ساعات من وضع مواد HIF تحصل استطالة قطرية وربما انقسام في خلايا القشرة قرب طرف الجذر. وفي الوقت نفسه يحصل نمو الشعيرات البشرة التي تتموضع حول المنطقة المنتفخة. في هذا الوقت يصبح الممص مهينا للاتصال بجذر العائل. المواد المحفزة لتكوين الممصات تضم 4 مجاميع هي Flavonoids و p- hydroxy acids و Quinones وهذه المجاميع الثلاثة مترابطة تركيبيا ويمكن أن تحفز تكوين الممصات بآلية الأكسدة - الاختزال (Redox) و Cytokinins وهي من الهرمونات النباتية والتي يمكن ان تكمل عمل المركبات السابقة عن طريق تغيير التوازن الهرموني لنسبة السايتوكاينينات إلى الأوكسينات (شكل 3). الجدير بالذكر أن هذه المواد تعتبر اليلوبائية (Allelopathic) تفرزها جذور النباتات من أجل تثبيط نمو جذور النباتات المنافسة (2001 ,Walker et al., 2003 ; Yoder).

حصول النبات الطفيلي على المحفزات HIFs

Parasite Probing for HIFs

توجد الفينولات المختلفة كمكونات مهمة من مواد جدران الخلايا النباتية حيث تلعب ادوارا في تكوين اللكنين والدفاع ضد الممرضات وغيرها. حوامض p- Hydroxy والفلافونات تكثر في الجذور وتنضح منها إلى التربة المحيطة بالجذر. مع ذلك لم تنجح تجارب عزل مركبات HIFs من ناضح الجذور السليمة، وعليه فإن اغلب المعطيات والاستنتاجات تشير إلى عمل إنزيمات النبات الطفيلي المفرزة إلى خارج الجذر في استخلاص هذه المركبات من جذور النباتات العائلة (Estabrook&Yoder, 1998).

في حالة جذور النبات الطفيلي S. asiatica وربما بقية النباتات الطفيلية تنتج خلايا البشرة بيروكسيد الهيدروجين H₂O₂ حيث لا يوجد إنزيم البيروكسيديز ولا الفينولات في أو على جدران هذه الخلايا مما يمكن جزيئات H₂O₂ من التراكم والانتشار في محيط الجذر وتعمل بمثابة " الكشاف الراداري " إذا صادفت جذور العائل التي تحتوي على سطحها إنزيم البيروكسيديز والفينولات سيحصل تحلل الجزيئات H₂O₂ هكذا يتم تحسس وجود جذور العائل من اختلاف تركيز H₂O₂ تعمل جزيئات H₂O₂ على سطح خلايا العائل كمواد أساس مساعدة وتؤدي إلى التحرير التأكسدي لجزيئات Benzoquinone xenognosins من جدران خلايا العائل حيث يحصل منحدر تركيز لهذه الجزيئات انطلاقا من جذر العائل ومؤشرا اليه. وهذه المواد هي محفزة لتكوين الممصات (شكل 3)(2001 ,.Keyes et al).

تبقى بذور النبات الطفيلي Striga ساكنة لحين تعرضها لمحفزات الإنبات الصادرة من العائل بشكل جزيئات Strigolactones. ثمة سؤال يبدو منطقيا، لماذا ينتج النبات العائل محفزات لإنبات بذور النباتات الطفيلية وهي ضارة له ؟ الجواب ان إنتاج النبات لهذه المواد وغيرها والتي يستفيد منها النبات الطفيلي وربما المسببات المرضية الأخرى ليس القصد منها إسداء خدمة للمسببات المرضية بل أنها ذات فوائد للنبات نفسه أو لأحياء أخرى نافعة له. فمادة Strigolactones تعمل كمحفز لتفرع الخيوط الفطرية لفطريات المايكورايزا الشجيرية الضرورية لنمو النبات العائل. كما أن هذه المواد و / أو مشتقاتها تعمل كهرمونات نباتية تنظم تفرع المجموع الهوائي للنباتات العائلة. المسألة إذا أن النبات الطفيلي كما تفعل على نحو مماثل بعض المسببات المرضية الأخرى يتعرف على هذه المواد الملازمة لنمو النبات العائل (Gomez Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008; Akiyama et al.,2005

الالتصاق (Adhesion)

يحقق النبات الطفيلي الاتصال بجذور العائل من خلال المواد الهلامية التي تنتجها شعيرات الممص. وهذا الاتصال ليس نوعيا فهو يمكن أن يحصل مع أي سطح حتى لو كان صناعيا (1998 ,Estabrook & Yader) التصاق النسيج ما قبل الممص للطفيلي بأنسجة العائل متطلب أساس لبدء الإصابة بالحامول. تماس النبات الطفيلي Cuscuta reflexa بسطح نبات الطماطة تحفز التعبير عن البروتين attAGP وهو بروتين (Arabinogalactan protein (AGP في العائل في موقع التماس مع الطفيلي. البروتين attAGP مرتبط بغشاء الخلية ويقع على جدار الخلية. بينت التجارب وجود علاقة بين مستوى تكوين هذا البروتين وقوة الالتصاق بالعائل. فعند تخفيض مستوى التعبير عن هذا البروتين تنخفض بشكل معنوي قوة التصاق الطفيلي بالنبات. يستنتج الباحثون أن النبات الطفيلي C. reflexa يرسل إشارة تحفز تكوين نبات الطماطة للبروتين attAGP لكي يوطد التصاقه بالنبات (2006 ,.Albert et al).

الاختراق (Penetration)

بعد تحقيق التماس والالتصاق، يخترق الممص نسيج العائل بواسطة القوة الميكانيكية الناتجة عن نمو الممص والتي تتوضح من وجود خلايا نباتية مهشمة للعائل في منطقة الممص والنشاط الإنزيمي الهاضم لجدران الخلايا النباتية. إن مساهمة الإنزيمات المحللة التي ينتجها النبات الطفيلي تظهرها بعض الدراسات التي تبين ان فعالية الإنزيم exo-1.4-ꞵ-d-glucosidase تزداد 50 ضعفا وإنزيم Xylanase يزداد 100 ضعفا وإنزيمات Pectin pectylhydrolase و Polygalacturonase تزداد 2 إلى 4 اضعاف في انسجة الممصات للنبات الطفيلي Cuscuta reflexa مقارنة بالأنسجة المحيطة بها يسهم الهضم الإنزيمي الذي تقوم به إنزيمات الممصات في تحرير مزيدا من جزيئات HIFs المحفزة لتكوين ممصات جديدة من جدران خلايا العائل

شكل 4 : ممص متصل بجذر نبات الذرة (a) نمي النبات الطفيلي T. versicolor  مع الذرة في اصص لمدة شهرين بعدها غسلت الجذور ونظفت من التربة وثبتت بمزيج FAA. الجذور المرتبطة بممصات رشحت وروقت من خلال وضعها في حامض الخليك 75 % وعقمت بالأتوكليف لمدة 15 دقيقة.

جذر Peters

الجسر الخشبي يكون داخليا بالنسبة للمص وثمة ممص ثاني متصل بالجانب السفلي من جذر الذرة. (b) رسم تخطيطي يوضح الصورة في (a)

عن : (Estabrook&Yoder, 1998).

وهذا ما يتوضح مع النبات الطفيلي Tripleysaria sp حيث تتجمع ممصاته حول جذور الذرة عند تنميتهما معا في الأصص لبضعة أسابيع (1998 , Estabrook & Yoder) (شكل 4) ويمكن أن تستخدم الإنزيمات المحللة Pectin methylesterase و Polygalacturonase و Endocolullase من قبل النباتات الطفيلية كما في حالة أنواع Orohanche للمساعدة في عملية الاختراق : 2004,Hurtado Losner-Goshen et al., 1998).

شكل 5 : النبات الطفيلي Cuscuta reflexa على التبغ الطفيلي يحقق تماس ناجح مع ساق النبات غير المعامل (A و C) ويفشل في ذلك عند المعاملة بمحلول الببتيد

عن: (Bleischwitz et al.,2010)

هذه الإنزيمات المحللة تستخدم من قبل العائل كوسيلة دفاعية ضد المسببات المرضية واخرى تستخدم من قبل المسببات المرضية كوسيلة تساعد على الاختراق.

للنبات الطفيلي Cuscuta جين يشفر لإنزيم سیستئین بروتيز هو Cuscutain يساعد على اختراق الطفيلي. ينتج الطفيلي الإنزيم وببتيد مثبط له ويوجه نحو خارج الخلية المنتجة. يتحفز نشاط الجين من خلال تماس الطفيلي مع سطح العائل وينشأ تدرج في تركيز الببتيد المثبط حيث يكون عاليا في خلايا الطفيلي ويقل تدريجيا باتجاه سطح العائل وبذلك يحمي الطفيلي خلاياه من النشاط المحلل للبروتيز بينما ينشط في منطقة تمامه بنسيج العائل ما يساعد على تفكيك جدران الخلايا وتسهيل الاختراق. كما أن وجود المواد البكتينية في نسيج الممص يساعد ايضا على توفير حماية إضافية ضد عمل الإنزيم. استخدام محلول مائي للببتيد برشه على النبات الملقح بالطفيلي خفض تكوين الممصات بنسبة 40% والإصابة من 65 إلى 15 %.

ويبدو أن الإصابة بالطفيلي تتطلب عددا أصغرا معينا حيث أن الطفيلي مات في هذه التجارب (شكل 5) وينتج النبات الطفيلي Orobanche إنزيمات مماثلة تساعد في اختراق العائل (2010 ,.Bleischwitz et al).

إذا كان النموذج العام لتكوين واختراق الممص لأنسجة العائل يعتمد نظام الاختراق المباشر الذي تستخدمه الفطريات بتكوين بروز اختراق مدبب، ثمة نموذج آخر لاختراق نسيج العائل يعرضه النبات الطفيلي شجرة عيد الميلاد الأسترالية Nuytsia oribunda حيث يتم تطويق جذر العائل بواسطة الممص وقطعه بواسطة تركيب سكلرنكيمي حاد قوي يشبه القرن ومن ثم إدخال نسيج الطفيلي ليخترق نسيج خشب العائل حيث يكون تركيب شبيه بالبالون ينحشر في فراغ أوعية الخشب المقطوعة (شكل 6).

العصير الخلوي لنسيج الممص يكون ذا سالبيه أكبر من عصير نسيج الطفيلي ما يمكنه من الحصول على الماء والعناصر الغذائية التي يوصلها إلى تيار النسخ الصاعد للطفيلي (2000 ,Calladine & Pate).

شكل 6 : ممصات النبات الطفيلي Nuytsia مصورة بالمجهر المعتم المجال. A : بادئة ممص مخروطي ينمو على جذر حديث. B: المرحلة المبكرة من تكشف الممص يظهر التفاف النسيج (cf) بما يشبه إصبعين متقابلين تنشأ من جذر الطفيلي (pr) لتحيط جذر العائل. C : ممص حديث حيث أزيل جذر العائل قبل تصويره. :D مص متكون حول قطعة خشبية، لاحظ التحام نهايتي نسيج الممص (سهم) على الجانب البعيد من جذر الطفيلي(pr) . E: ممص غير طبيعي (ha) متكون على عقدة جذرية للنبات البقولي Acacia Cyclops يفشل في الوصول إلى النضوج الخطوط (A و B) -  1ملم ، (C) - 1.3 ملم،D) ) -  4.4ملم، E - 1.6 ملم

عن : (2000 ,Calladine & Pate)

الإصابة (Infection)

الإصابة في حالة الفطريات والبكتريا هي المرحلة التي تلي الاختراق وتتضمن توطيد الصلة الغذائية وتحقيق قدر من النمو مع ما يتطلبه الأمر من تحييد أو تثبيط دفاعات العائل التي تعيق تحقيق هذه الأهداف. في حالة النباتات الطفيلية يحدث المبدأ نفسه لكن بشكل يتناسب وطبيعة المسبب المرضي الذي هو نبات له أعضاء معقدة ومتميزة. بعض المسببات المرضية الأخرى تستخدم رفع حالة الأكسدة لأنسجة العائل عن طريق تكوين جذور الأوكسجين الفعالة ROS من أجل إضعافها أو قتلها تسهيلا لاختراقها أو غزوها وهكذا فإن تكوين ROS هي أحدى آليات مهاجمة العائل. بين (2008 ,.Mor et al) أن النبات الطفيلي O. aegyptiaca يصدر جزيئات ROS إلى انسجة العائل عن طريق نشاط الإنزيم Peroxidase في منطقة طرف الجذر المخترق كي يلين الأنسجة للمساعدة في اختراقها.

من اجل توطيد الصلة التشريحية لأنسجة الطفيلي الناقلة مع الأنسجة الناقلة للعائل، والتي هي متطلب أساسي للحصول على الماء والعناصر الغذائية، يقوم الطفيلي بسحب وتركيز هرمونات النبات (الأوكسينات) المطلوبة في توجيه النمو المستقطب للأنسجة الناقلة في منطقة اتصال الأنسجة بين العائل والطفيلي من أجل تحقيق الاندماج النسيجي. هنا تسلك أنسجة الطفيلي سلوك الجذر وليس سلوك المجموع الهوائي (2008 ,.Bar-Nun et al).

من البديهي أن تتضمن عملية الإصابة بالنباتات الطفيلية كما في المسببات المرضية الأخرى تنشيط جينات الطفيلي التي تسهم في توفير الإنزيمات والبروتينات والمركبات التي تساعد على تحقيق الإصابة وتعطيل دفاعات العائل. جزء من هذه العملية توضح في دراسة إصابة النبات البقولي النموذجي Lotus japonicas الذي هو عائل للنبات الطفيلي Orobanche aegyptiaca وغير عائل للنبات الطفيلي Striga hermonthica كمقارنة خلال عملية الإصابة يتم تنشيط جينات تكوين العقد في حالة O. aegyptiaca كما يتم تنشيط 19 جينا من بين 48 جينا ذات علاقة بالإمراضية بينما تنشط 5 جينات فقط من بين 48 جينا في حالة النبات الطفيلي غير الضاري S. hermomthica خلال اليوم الأول من الإصابة تؤدي الإصابة بالطفيلي الضاري O. aegyptiaca إلى زيادة التعبير بشكل جهازي في النبات العائل عن 4 جينات بضمنها تلك المسؤولة عن تثبيط Trypsin protease. هذا لا يحصل في حالة الإصابة بالنبات الطفيلي غير الضاري S. hermonthic كون النبات ليس عائلا له ( Hiraoka et al., 2009).

نضج الممص ( Haustorium Maturation)

بعد اختراق الممص لأنسجة الجذر يستمر بالتوسع من خلال انقسام وتوسع خلايا القشرة وتكوين حسر خشبي (Xylem Bridge) مربط عناصر الخشب لجلد الطفيلي مع مثيلاتها للعائل (شكل 4). إن عناصر الخشب للطفيلي تنشا نتيجة تمايز خلايا القشرة في طرف الممص وتمتد نحو جذر الطفيلي عند اندفاعها نحو جذر العائل والتماس معه تحديدا. هذا ينتج بسبب تحفيز مواد إشارية من العائل. بعد تكوين الجسر الخشبي تبدأ عملية نقل المواد الغذائية باتجاه واحد من النبات العائل إلى النبات الطفيلي. المواد المنقولة تشمل الماء والعناصر المعدنية والاحماض الأمينية والكاربوهيدرات وغيرها من الجزيئات الكبيرة مع ذلك يمكن ان تبدأ ردود الفعل المقاومة ما بعد الغزو عبر الجزيئات الإشارية المتبادلة فالنبات الطفيلي S. gesnerioides مثلا يمكن ان يخترق قشرة جذر نبات اللوبياء B301 المقاوم ويقيم جسور خشبية لكنه يفشل في التطور اللاحق والنمو (1998 ,Estabrook & Yoder).

من خلال مقارنة مكونات عصير الخشب للنباتات العائلة المتوطنة مع نظيراتها في ممص النبات الاختياري التطفل Santalum acuminatum تبينت المعطيات التالية : كل عائل ينقل مذابات نتروجينيه عضوية خاصة به ولكن بدون أو مع القليل من النترات وجريان مباشر محدود للمركبات الأمينية بين نسغ خشب العائل والطفيلي. الحامض الأميني برولين يسود في ممص وخشب النبات الطفيلي لكنه يكون بتراكيز تهمل في خشب معظم النباتات العائلة السكروز والفركتوز والكلوكوز وحامض الماليك والستريك توجد بتراكيز عالية في جميع النباتات لكن الفركتوز تركيزه مرتفع في النبات الطفيلي الكلوريد والكبريتات والفوسفات هي الأيونات السالبة اللاعضوية في الخشب. النبات الطفيلي يحصل على ثلث احتياجاته من الكاربون من خشب العائل. ويحصل الطفيلي على 40 - 80 % من احتياجاته من النتروجين بشكل برولين من العائل. ثمة نشاط لإنزيم Nitrate reductase الممص بعد الحصول على النترات من العائل. يلعب الممص في النبات الطفيلي Santalum دورا رئيسا في تخليق وتصدير البرولين وبذلك يؤدي دورا مهما في ضبط الجهد الأزموزي للطفيلي وما يتبعه من اكتساب الماء من العائل (1997 ,.Tennakoon et al).

مقاومة النبات للإصابة

Resistance of Plant to Infection

إن مقاومة النبات ضد الإصابة بالنباتات الطفيلية عملية معقدة نتجت عن مراكمة العديد من الجينات خلال عمليات التأثر المتبادل بينه وبين الطفيلي. وحيث ان النبات يتغير باستحداثه آليات مقاومة جديدة، يطور النبات الطفيلي آليات إمراضية وضراوة جديدة خلال عملية سباق التسلح كما هو الحال مع المسببات المرضية الأخرى ( 2002 ,.Femández-Martinez et al., 2000; Roman et al)۔

في مقاومة الإصابة بالنباتات الطفيلية، تستخدم النباتات ستراتيجية تتألف من ثلاثة خطوط دفاعية : خط الدفاع الأول يتمثل بعدم تحفيز إنبات البذور كما هو الحال ضد نبات الهالوك. خط الدفاع الثاني يتركز حول منع أو تثبيط اختراق أنسجة العائل وتحقيق الصلة. مع الأنسجة الوعائية وخط الدفاع الثالث يحصل لإفشال نمو الطفيلي وانتشاره (2009 ,.Castillejo et al).

1 . عدم تشجيع التلقيح

في مجال عدم أو قلة تكوين جذور العائل لمحفزات إنبات بذور النباتات الطفيلية، ثمة عدد من أصناف البقوليات وعباد الشمس في حالة Orobanche والذرة البيضاء والذرة في حالة Striga. كما تتم الاستفادة من قدرة بعض النباتات على إفراز مثبطات إنبات البذور أو انخفاض إنتاج عامل تحفيز تكوين الممصات في حالة Striga و Tryphisaria. وتتم الاستفادة أيضا من بعض الصفات المظهرية الفسلجية كتكوين مجموع جذري صغير أو نمو الجذور إلى أعماق أكبر ما يقلل من فرص إصابة النبات.

2. المقاومة قبل تكوين الممصات

بعد نجاح النبات الطفيلي من تحقيق التلقيح في النباتات المقاومة يحصل تلون داكن في النسيج حول نقطة اتصاله بالجذر. هذا يمكن ان يحصل بتكرارية أقل في النباتات الحساسة. يمكن إيقاف محاولة الطفيلي كما في حالة الهالوك من تكوين خلايا الاختراق في 3 مواقع : الأول : منطقة القشرة والثاني في البشرة الداخلية والثالث في الأسطوانة المركزية في جميع الحالات تؤدي ردود الفعل هذه إلى تلون النسيج وإفشال تطور بادرة الطفيلي لكن آليات المقاومة تكون مختلفة.

آلية المقاومة في منطقة القشرة تعتمد على تقوية جدران الخلايا بواسطة البروتينات الرابطة وترسيب الكالوس وسوبرة جدران الخلايا وفي بعض الحالات تكوين مركبات فينولية سامة في منطقة الجوار البلازمي. في منطقة البشرة الداخلية المقاومة تعتمد أساسا على لكننة جدران خلايا البشرة الداخلية والدائرة المحيطية. أما في منطقة الأسطوانة المركزية فلا يحصل تقوية لجدران الخلايا بل تكوين مركبات فينولية سامة يشير اليها انبعاث وميض من أوعية الخشب والخلايا المحيطة.

3. المقاومة ما بعد تكوين الممصات

عند نجاح الطفيلي في تحقيق الاختراق وتكوين الممص يصبح في حالة تكامل مع النبات العائل من خلال اندماجه مع الأنسجة الناقلة للعائل. عدم قدرة الطفيلي على النمو وتكوين النورة الزهرية يشير إلى وجود مقاومة.

هذه المقاومة تعتمد على تكوين مواد جيلية وصمغية تغلق أوعية العائل ما يعيق تمكن الطفيلي من النمو والحصول على الماء والمواد الغذائية المطلوبة. مثل هذه الآلية تعمل ضد الفطريات والبكتريا المسببة لأمراض الذبول. كما تستخدم المركبات الفينولية السامة المثبطة لنمو الطفيلي.

يبدو أن آليات مقاومة النباتات للإصابة مشابهة لتلك الموجهة ضد الإصابة بالمسببات المرضية الأخرى فهي تشمل تكوين المركبات المضادة كالفايتوالكسينات ( 2007 ,.Serghini et al., 2001; Fan et al) والانفجار التأكسدي بتنشيط الإنزيمات المؤكسدة مثل البير و اكسيديزات ) .Goldwasser et al., 1999; Pérez-de-Luque et al2005a) وترسيب الكالوس وتقوية جدران الخلايا بلكننتها خصوصا في منطقة البشرة الداخلية 2005 ,.Goldwasser et al., 1999; Pérez-de-Luque et al) وتكوين البروتينات المرتبطة بالإمراضية وإغلاق أوعية الخشب بتكوين مواد جيلية وتغيير المسارات الأيضية (2007 ,.Joel & Portnoy, 1998; Lozano-Baena et al).

أوضح (2006 ,.Echevarria-Zomeno et al) أن مقاومة نبات عباد الشمس لطفيلي الهالوك نوع Orobanche cumana تتضمن سوبرة وتكوين بروتينات رابطة في جدران خلايا النبات لتوفير الإعاقة الميكانيكية ضد اختراق جذير الطفيلي وتكوين مركبات فينولية مضادة.

مع وجود مفاهيم مسبقة عن آليات مقاومة النباتات للممسببات المرضية المختلفة والتي يمكن ان تكون مماثلة لما يحصل ضد النباتات الطفيلية وهذا يسهل الدراسة، فإن التشابه الكبير بين النباتات الطفيلية والنباتات العائلة كونهما يعودان إلى المملكة الأحيائية نفسها ويشتركان في الكثير من الخواص المظهرية والفسلجية يعقد كثيرا من دراسة آليات المقاومة. لذلك كثيرا ما يلجأ الباحثون في هذا المجال إلى استخدام الطرق الكيموخلوية والجزيئية لتحقيق هذا الغرض.

تظهر الدراسات النسيجية للإصابة والمقاومة بطفيلي الهالوك نوع Orobanche crenate على جذور الصنف الحساس أو المقاوم لنبات الجت Medicago truncatula أن ثمة مقاومة مبكرة وأخرى متأخرة.

في المقاومة التي يظهرها الخط الوراثي المقاوم SA27774، الطفيلي يموت قبل تكوينه للعقد (شكل 7)

أما المقاومة المتأخرة التي يظهرها الخط الوراثي المقاوم SA4327 فتحصل بعد الإصابة حيث ينجح الطفيلي في اختراق جذر العائل وتكوين صلة طفيلية وعقد لكن هذه العقد تصبح داكنة اللون وتموت قبل البزوغ (2007 ,.Lozano-Baena et al) (شكل 8).

شكل 7 : مقاطع مصبوغة بـ A-TBO : مقطع عرضي لإصابة ناجحة بالطفيلي Orohanche create على السلالة الحساسة لنبات الجت B.Medicago runcatula : تفاصيل A تظهر الأسطوانة المركزية وأوعية الخشب للعائل في تماس مع خلايا الطفيلي حيث تبدأ بعض أوعية خشب الطفيلي بتكوين اتصالات مع أوعية العائل. C : مقطع عرضي تظهر اختراق بادرة النبات الطفيلي للعائل. D : تفاصيل C تظهر الأسطوانة المركزية وأوعية خشب العائل وهي في تماس مع خلايا الطفيلي. E : مقطع عرضي تظهر الاختراق غير الناجح للطفيلي على صنف مقاوم من النبات M. rancatala. F: تفاصيل تظهر تثخن جدران خلايا الخشب (سهام) وهي في تماس مع خلايا الطفيلي وتراكم مادة داكنة الصبغة (رؤوس سهام). PS : بادرة الطفيلي pic : خلايا الاختراق للطفيلي : قشرة العائل، hcc : الأسطوانة المركزية للعائل، hx : أوعية خشب العائل px : أوعية خشب الطفيلي

عن : (2007 ,.Lozano-Baena et al)

شكل 8 : مقطع طولي في جذر نبات الجت Medicago truncatla غير مصاب .C : مقطع طولي في جذر نبات الجت الحساس مصاب بالطفيلي Orohanche create حيث يكون عقدة. E : مقطع طولي يبين اختراق غير ناجح لبادرة الطفيلي على جذر الصنف المقاوم لنبات الجب. G : مقطع عرضي في عقدة الطفيلي المسودة على الصنف المقاوم من الجت hc : قشرة العائل hoc : الأسطوانة المركزية للعائل pha: ممص الطفيلي، pt : عقدة الطفيلي، pao : عضو النصاف الطفيلي pic : خلايا الاختراق للطفيلي

عن : (2007 ,.Lozano-Baena et al)

شكل 9 : (A) مقطع عرضي في العلاقة غير التوافقية بين الطفيلي الهالوك Orobanche Crenata ونبات البزاليا معامل بصبغة Coomassie blue بعد المعاملة بـ SDS. السهام تشير إلى البروتينات الرابطة على جدران خلايا العائل. (B) تفاصيل شكل (C) .(A) تفاصيل (A) يظهر خلايا العائل الطبيعية بدون البروتينات الرابطة CC - الأسطوانة المركزية، Cix - القشرة، pic - خلايا الاختراق للطفيلي، Hc - خلية العائل

عن: (Pérez-de-Luque et al.,2006)

وعلى نبات البزاليا المقاومة، أظهرت الدراسات الكيموخلوية أن الطفيلي O. crenate بوقف في قشرة جذر العائل قبل أن يصل إلى الأسطوانة المركزية، ذلك يترافق مع تراكم H₂O₂ وإنزيمات بيروكسيديز والكالوس في الخلايا المجاورة، كما يظهر أن الربط العرضي للبروتين في جدار خلية العائل من الوسائل الدفاعية العائقة لاختراق الطفيلي. وتبين أن التعبير عن الجينات المسؤولة عن ꞵ-glucanase وبيروكسيديز يكون مختلفا في النباتات المقاومة للطفيلي ( Perez de-Luque et 2006 ,.al) (شكل 9).

من المعروف أن (Salicylic acid (SA يعمل كجزيئة إشارية تحفز المقاومة المكتسبة الجهازية (Systemic Aquied Resistance) (SAR) ضد المسببات المرضية الفطرية والبكتيرية والفايروسية ويعمل المركب الشبيه لـ SA وهو Somethyl (benzo 1,2,3Jthiadiazole-3-carbothioate (BTH تأثيرا مماثلا & Vallad

(Goodman, 2004; Anand et al., 2008; Attaran et al., 2009; Du et al., 2009; كما يعمل المركب (Jasmonic acid (A كناقل إشاري في SAR ولكن بطريقة مختلفة (2008 ,.Truman et al., 2007 : Chern et al) بينت الدراسات أن نقع بذور عباد الشمس بمحلول المركب BTH خفض عدد اتصالات النبات الطفيلي الهالوك نوع Orobanche Conana إضافة محلول BTH إلى التربة أعطى نتائج مشابهة مع الهالوك نوع O ramose. على نبات التبغ و O.cumana على عباد الشمس. كما ان رش محلول BTH على أوراق نبات البزاليا خفض اتصالات النبات الطفيلي O. crenata استخدام محاليل SA أو BTH على جذور نبات النقل Trifolium pretense خفض إصابة جذور هذا النبات بالطفيلي O. minor بنسبة تزيد عن 75 %. استخدام Methyl (Jasmonate (MeJA أو (n-propyl dihydrojasmonate (PDJ بطريقة مماثلة لم يؤثر على معدل الإصابة بالطفيلي. تخفيض الإصابة بواسطة SA أو BTH يرجع إلى تثبيط إستطالة جذير الطفيلي وتحفيز الإستجابات الدفاعية للعائل بضمنها لكننة خلايا البشرة الداخلية للجذور. وهكذا يستنتج الباحثون إلى أن SA وليس Mela من يحفز Kusumoto et al., 2007)SAR) المعروف أن MeJA يحفز مع هرمون الأثيلين والسكريات الدهنية المقاومة الجهازية المستحثة (Induced Systemic Resistance) ضد المسببات المرضية (2006 ,Pal & Gardener) كما أن استخدام المركب Prohexadione-calcium وهو مثبط لتخليق هرمون الجبريلين ويسبب تراكم المواد الفينولية يحفز مقاومة عباد الشمس ضد الطفيلي Fan et al., 2007)0.cumana).

مقاومة محاصيل البقوليات للهالوك من نوع O. crenata تكون متعددة الجينات وضعيفة التوارث جدا ما يصعب من مهمة برامج التربية والتحسين (2003 ,Rubiales).

تشخيص النباتات المقاومة

Identification of Resistant Plants

ثمة عدد من الطرق الكيمونسيجية التي يمكن استخدامها في دراسة المقاومة وتحديد آلياتها تجاه الطفيليات المتطفلة على الجذور. يمكن دراسة المقاومة خارج الجسم الحي بوضع الجذور المصابة بالطفيلي في طبق بتري ومتابعة تطور الإصابة بمراحلها المختلفة. يمكن تثبيت الجذور المصابة في محلول Ethanol 50% ) FAA Formaldehyde 5% + Gglacial Acetic Acid 10%, H2O) لمدة 48 ساعة والطمر بالبارافين ومن ثم عمل مقاطع بواسطة الميكروتوم والصبغ بصبغات نسيجية ووظيفية مختلفة والفحص بالمجهر الضوئي أو المجهر الفلوريسيني.

1- صبغة Alcian Green Safranin

صبغة عامة، تظهر الكاربوهيدرات بما فيها جدران الخلايا والمواد الهلامية باللون الأخضر أو الأصفر أو الأزرق، بينما جدران الخلايا الملكننة والمسوبرة والمحتوية على الثانين فتظهر باللون الأحمر.

2 - صبغة (Toluidine Blue O (TBO

TBO  0.5 % في بفر الفوسفات (5.5 Ph) تستخدم قبل إزالة البارافين. تفيد في تحسس المركبات الفينولية والتانينات واللكنين والسوبرين.

3- Aniline Blue Fluorochrome

تستخدم لكشف وجود الكالوس تحت وميض الأشعة فوق البنفسجية (340-380 ن م ).

Ruthenium Red  -4

تستخدم للكشف غير المباشر لنشاط الإنزيمات المحللة للصفائح الوسطى وجدران الخلايا حيث تظهر المواد البكتينية غير المثيلية باللون الأحمر/ الوردي.

5- كشف البروتينات الرابطة

يمكن كشف وجود البروتينات الرابطة في جدران الخلايا باستخدام طريقة (2002 ,.Mellersh et al) تقطع النماذج المثبتة يدويا وتغمر في محلول Sodium (Dodecyl Sulphate (SDS تركيز 1% لمدة 24 ساعة في درجة حرارة 80 م. تصبغ لمدة 3 - 5 دقائق بصيغة Coomassie blue (1% في الكحول الأثيلي 40 % / حامض الخليك 10%)، تغسل بمحلول الكحول الأتيلي 40 % / حامض الخليك 10 % وتحمل بالماء على شريحة زجاجية وتفحص المعاملة بـ SDS ستزيل معظم البروتينات الذائبة بينما تتلون البروتينات الرابطة في جدران الخلايا باللون الأزرق الغامق.

6- كشف وجود H2O2 ونشاط إنزيمات Peroxidase

تغمر النماذج الطرية بصبغة (3,3 -diaminobenzidine (DAB (1 ملغم/ مل ماء مقطر، 3.8 ph) لمدة 2-3 ساعات. تغسل النماذج بمزيج حامض اللاكتيك / كليسرول / ماء (1:1:1) لمدة ساعة تقطع يدويا وتحمل بالمزيج على الشريحة. ظهور تلون بني داكن يشير إلى نشاط إنزيمات Peroxidase ووجود H2O2 في الأنسجة.

في الواقع يفضل استخدام أكثر من طريقة واحدة للتأكد من صفة المقاومة المدروسة.

الطرق النسيجية الجزيئية

Molecular Histology

مجهر التبئير الليزري الماسح

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

هذه التقنية توفر معلومات قيمة لملاحظة الأيضات المضيئة كالمركبات الفينولية في الخلايا من النماذج الطرية وتسمح ببناء نماذج ثلاثية الأبعاد. فالتقطيع الضوئي يجنب فقدان وتحطيم المواد النسيجية التي تحصل بالتقطيع التقليدي. كما تسمح بربطها بطرق المناعة الخلوية باستخدام أجسام مضادة مرتبطة بمواد مومضة.

تحديد جين خصوصي في النسيج

Localisation of a Specific Gene within the Tissue

هذه الطريقة تتضمن التهجين في الموقع (In Sita Hybridisation) بجزيئات mRNA ما يسمح بدراسة التعبير الجيني تحت ظروف معينة وفي الخلايا والأنسجة تحت الدراسة. يمكن ربط هذه التقنية مع CLSM باستخدام موسمات مومضة (Fluorescent In Situ Hybridisation:FISH) التي تمكن من التحديد الدقيق للجينات المهمة المعبر عنها.

تحديد مجاميع من الجينات ضمن النسيج

Isolation of a Large Number of Genes within Tissue

تضمن هذه الطريقة استخدام عدد من التقنيات (RT-PCR ،Microarrays، Protcomic، الخ. إضافة إلى تقنية (Laser Capture Microdissection (LCM. تسمح تقنية LCM لعزل وتحسس الجينات المعبر عنها في النسيج ) Perez-de-Luque et.al., 2008; Castillejo et al., 2009

المقاومة بواسطة الهندسة الوراثية

Resistance by Genetic Engineering

ثمة تطبيقات عديدة للهندسة الوراثية في النباتات جزء مهم فيها إيجاد أو تطوير قابلياتها الدفاعية ضد المسببات المرضية والحشرات. النباتات الطفيلية جزء مهم من المسببات المرضية وعليه فهي ليست بعيدة عن اهتمام العلماء في هذا المجال وحيث أن الأبحاث في هندسة وراثة المقاومة ضد النباتات الطفيلية لازالت في بدايتها، فإنها تركزت على الأنواع الأكثر أهمية المتمثلة بالهالوك ودغل الساحرة والحامول. ومع أن الهندسة الوراثية تعتمد مبدأ النقل الجيني في تحقيق أهدافها، إلا أن التقانات المستخدمة والجينات المعتمدة وطرق نقلها تختلف حسب هذه العوامل والأحياء المشتركة في هذه العملية.

إحدى التقانات المستخدمة هي الإخماد الجيني المعتمد على التشابه في تتابعات معينة بين (RNA interference (RNAi والجين المستهدف بتكوين RNA مزدوجة الشريط (double stranded RNA (RNA المعروف أن النباتات الطفيلية تحصل على المواد الغذائية و/ أو الماء من النباتات العائلة وتتبادل الجزيئات معها. بينت الأبحاث الحديثة أن جزيئات mRNAs يمكن أن تنتقل بين النبات العائل والنبات الطفيلي. وهكذا تم كشف وجود 474 من المنسوخات المتحركة في نبات الحامول المتطفل على الطماطة، كذلك جزيئات mRNAs لأربعة جينات من الطماطة في الحامول المتطفل عليها. كما أن RNAi تنتقل بين النبات العائل والنبات الطفيلي. ومن خلال معرفة المسارات الايضية الأساسية والإنزيمات المفتاحية في فسلجة النبات الطفيلي فإن تزويد العائل بجينات تشفر لجزيئات siRNA خصوصية يمكن ان تنتقل إلى النبات الطفيلي وتهاجم mRNAs للإنزيم المستهدف وتثبط تخليقه كمثال أيض السكر المعتمد على مسار تخليق المانيتول في النبات الطفيلي الهالوك والإنزيم (Mannose - 6 - phosphate reductase (M6PR حيث بينت الابحاث دوره الأساس في حياتية النبات الطفيلي. تثبيط هذا الإنزيم بواسطة siRNA خصوصية تتكون في العائل المحور وراثيا، سيحرم الطفيلي من مصدر الكاربون الأساس له وبالتالي يؤدي إلى تدهوره وحصول المقاومة، وهكذا تم استحداث نباتات طماطة محورة وراثيا تحمل M6PR dsRNA-expression cassette حيث تنتج M6PR-SiRNA وهذه الجزيئات غير موجودة في النبات الطفيلي Orobanche aegyptiaca . وهكذا بينت نتائج الكشف بواسطة جهاز RT-PCR أن مستوى M6PR mRNA في الدرنات (الممصات) والأجزاء تحت الأرضية للطفيلي النامي على نبات الطماطة المحور وراثيا انخفضت بنسبة 60 - 80%. هذا تصاحب مع انخفاض معنوي في مستوى المانيتول وزيادة معنوية في موت درنات النبات الطفيلي ( 2010 .Aly et al., 2009 : Niu et al).