تحدد الطرائق الفيزيائية الوزن الجزيئي والبنية الرابعية

يتضمن تحديد البنية الرابعية للبروتينات قليلة المواحيد (قليلة الوحدات او المونمرات اي منخفضة الوزن الجزيئي) تحديد عدد المواحيد ونوعها وتوجهها والتآثرات فيما بينها. وإذا افترضنا أن قليل المواحيد لا يتمسخ خلال الطرائق المستخدمة لتحديد الأوزان الجزيئية، فإن هناك العديد من الطرائق التي تعطي معلومات حول الوزن الجزيئي، ويمكن استخدام هذه الطرائق لتحديد الوزن الجزيئي لوحيدة فقط إذا جرى تمسخ قليل المواحيد أولا:

1     - التنبيذ الفائق التحليلي (Analytical ultracentrifugation): طور سفيدبرج هذه الطريقة التي تمكننا من قياس معدل ترسب البروتين في حقل جاذبية يبلغ نحو 10⁵ X ج (وحدة تسارع (g) تعبر عن التسارع الناجم عن جاذبية الأرض على مستوى سطح البحر: 1 ج = 9.80665 متر/ثا²). هذه التقنية ممتازة في مجال تحديد الوزن الجزيئي لكن طرائق أخرى أقل تعقيداً حلت مكانها في السنوات الأخيرة.

2     - التنبيذ في تدرج كثافة السكروز Sucrose density gradient centrifugation: أفضل ما تطبق هذه الطريقة على البروتينات الكروية بحيث توضع البروتينات المعيارية (Standards) والمجاهيل بشكل طبقات على مدروج مدروء (Buffered) من السكروز 5-20 % يحضر بالتجميد والصهر المتكرر للسكروز ذي التركيز 20 % وبعد التنبيذ طوال الليل تؤخذ محتويات الأنبوب قطرة قطرة وتحلل بحثاً عن البروتين. ويجري حساب مدى حركية البروتين المجهول نسبة إلى حركية البروتينات المعيارية ذات الأوزان الجزيئية المعروفة ثم حديد وزنه الجزيئي.

3     - الترشيح الهلامي: تستخدم بروتينات معيارية ذات أوزان جزيئية معروفة

لتعيير (Calibration) أعمدة (Columns) من السيفادكس أو أي أطوار ثابتة (Matrices)  أخرى مشابهة تحوي مسامات (Pores) مجالات أبعادها معروفة؛ ثم حسب الأوزان الجزيئية للبروتينات المجهولة من موضع شطفها (Elution) نسبة لتلك البروتينات المعيارية. وقد حصل أخطاء كبيرة إذا كان البروتين غير متناظر أو يتآثر بقوة مع المادة التي صنع منها المنخل الجزيئي.

4     - الرحلان الكهربي على هلامة عديد الأكريلاميد (PAGE) : يجري فصل البروتينات المجهولة والمعيارية بالرحلان الكهربي على هلامات من الأكريلاميد المتصالب (5-15 %) ذات مسامات مختلفة الأبعاد يجري تلوينها لاحقاً لكشف البروتين باستعمال ملون ررقة كوهازي أو أيونات الفضة. وتستخدم تقنية SDS-PAGE لتحديد حجم وحيدات البروتينات قليلة المواحيد. وللقيام بذلك يجري أولا تسيخ البروتين بغليه بوجود بيتنا - مركبتو الإيثانول -mercaptoethanolβ والمنظف (Detergent) الأيوني المشحون سلبيا SDS، فتصبح البروتينات المتمسخة مغلفة بمركب SDS (أي أن شحنتها كلها سلبية) مما يسمح بفصلها على الهلامات الحاوية على SDS اعتماداً على حجمها فقط (وليس على شحنتها).

5     - يظهر المجهر الإلكتروني المركبات كبيرة الجزيئات Macromolecular complexes: يستطيع المجهر الإلكتروني التكبير حتى 100,000 مرة فيوضح لنا أجزاء الفيروسات والمعقدات الإنزيمية والبروتينات قليلة المواحيد وقليلات المواحيد ذات الوزن الجزيئي المرتفع.