سيرولوجي الفيروسات النباتية Serology of plant viruses

عند إصابة الحيوان بمرض بكتيري أو فيروسي يظهر في دم الحيوان مواد بروتينية لها القدرة على أن ترتبط بالمسبب المرضى. تلك المواد البروتينية يطلق عليها الأجسام المضادة antibodies. هذا التفاعل، أي ارتباط الأجسام المضادة بالمسبب المرضى، هو إحدى طرق مقاومة الحيوان للمرض. من الممكن ملاحظة الأجسام المضادة في سيرم الحيوان المصاب وذلك لقدرتها على أن تتحد خارج الجسم in vitro مع البكتريا أو الفيروس المسبب للمرض. اتحاد او تفاعل الأجسام المضادة هو أساس كل الاختبارات السيرولوجية. تلاحظ الأجسام المضادة كثيرة في دم وبعض أنسجة الحيوان الأخرى بعد مرور وقت طويل من شفائه وهي تعمل على حماية الجسم من عدوى أخرى بنفس البكتريا او الفيروس.

لا يعمل الحيوان على تكوين الأجسام المضادة استجابة لسبب مرضي فقط قد أصابه وإنما يعمل على تكوينها أيضا إذا ما حقن في جسمه مواد مختلفة تعتبر غريبة عنه. أي مادة لها القدرة على تنشيط تكوين الأجسام المضادة والدخول مع تلك الأجسام المضادة في تفاعل إذا ما خلطت بالمصل المستخلص من الحيوانات التي حقنت بها يطلق عليها الأنتيجين antigen .

الإنتيجينات غالبا ما تكون مواد ذات طبيعة بروتينية. عديدات التسكر polysaccharites والدهون lipids ذات خواص أنتيجينية أيضا. بعض الجزيئات الصغيرة ذات التركيب الخاص مثل الأحماض الأمينية عند حقنها في الحيوان لا تنشط إنتاج الأجسام المضادة ولكن قد يكون لها القدرة على التفاعل مع الأجسام المضادة التي أنتجت نتيجة لحقن الحيوان بأنتيجينات كبيرة تحتوي على تلك الجزيئات الصغيرة كجزء من تركيبها. يطلق على تلك الجزيئات الصغيرة الهابتينات .haptons

عموما تتميز الأنتيجينات بأنها ذات وزن جزئ أكبر من 10.000 فشلا بروتين الدم ذو وزن جزيء 60.000 والبيومين البيض ذو وزن جزيء 40.000 وهذه تعتبر أنتيجينات مثالية. البروتينات النباتية هي أيضا أنتيجينات نشطة. الفيروس النباتي ما هو الا نيكلوبروتين أي يحتوي على البروتين في تركيبه وبما أن البروتين الفيروسي ذا وزن جزئ كبير جدا ( بروتين فيروس موزايك الدخان ذا وزن جزيء يساوى 37 مليون ) لذا فهو ذو فاعلية كبيرة في تنشيط تكوين الأجسام المضادة. المصل serum الذي يحتوى على الأجسام المضادة antibodies يطلق عليه المصل المضاد antiserum، أما مصل حيوان التجارب الذي لم يحقن بأي أنتيجين فيطلق عليه المصل المادي normal serum. بروتين الأجسام المضادة يكون من النوع جاما جلوهولين globulin ۔Y.

تتميز التفاعلات السيرولوجية بتخصصها العالي وشدة حساسيتها. بمساعدة الطرق السيرولوجية أحيانا يمكن التمييز بين مواد قريبة تظهر متطابقة عند دراستها بطرق أخرى ، كما يمكن ملاحظة التفاعل بسهولة بين كمية بسيطة من الانتيجيز والأجسام المضادة نتيجة لاتحاد كل منهما بالآخر. يعتقد أنه يوجد على سطح الاجسام المضادة مناطق خاصة لها القدرة على الارتباط مع ما يسمى بالمجاميع المحددة determinant groups الموجودة على سطح الأنتيجين، وعلى هذا فان الاختلافات السيرولوجية بين اثنين من الأنتيجينات تعكس الاختلافات في تركيب سطوحهما.

من الجوانب السلبية لاستخدام الطرق السيرولوجية هو عدم امكان الحصول على أمصال مضادة لكل الفيروسات التي تصيب النباتات الراقية، فقد فشل كثير من الباحثين في تحضير مصل مضاد الفيروس التفاف أوراق البطاطس. يعزى هذا الفشل إلى عدة تكهنات منها أن هذا الفيروس ليس له القدرة على تكوين أجسام مضادة عند حقنه في الحيوان إذ كان من المعتقد سابقا أن هذا الفيروس عبارة عن حامض نووي عاري ولكن هذا التكهن أصبح غير مقبول وخاصة بعد الحصول على تحضيرات نقية من الفيروس، أما الأسباب الأخرى فيمكن أن تعزى إلى أن تركيز الفيروس في النبات يكون ضعيفا أو أن الفيروس يفقد عند تحضيره واستخلاصه من العصير وذلك لعدم مقاومته لبعض العوامل الطبيعية والكيماوية. وعلاوة على هذا فان هناك فيروسات أخرى لم يمكن الحصول على أمصال مضادة لها مثل بعض فيروسات الخس وعديد من الفيروسات الأخرى.

وقد وجد أن هناك علاقة بين سهولة الحصول على مصل مضاد لفيروس ما وطريقة انتقال هذا الفيروس. فالفيروسات التي تنتقل ميكانيكيا بالعصارة يسهل إنتاج أمصال مضادة لها، بعكس معظم الفيروسات التي تنتقل عن طريق الحشرات فقط فيصعب تحضير أمصال لها.

تحضير المصل المضاد

عند حقن تحضير فيروسي في دم حيوان من حيوانات التجارب فان بعض أنسجة الحيوان تبدأ في تكوين أجسام مضادة خاصة تتفاعل مع الفيروس الذي نشط إنتاجها. إذا استخدم في عملية الحقن تحضيرات فيروسية غير نقية تحتوى بجانب الفيروس على شوائب نباتية ذات خواص أنتيجينيه فان المصل المضاد المتحصل عليه سوف يحتوي على نوعين من الأجسام المضادة أحدهما ضد الفيروس والآخر ضد الشوائب البروتينية النباتية، وهذا سوف يمثل عقبة كبيرة عند استخدام المصل المضاد للتعرف على الفيروس وخاصة إذا كان تركيز الأجسام المضادة للشوائب النباتية عاليا. وعلى هذا فان النجاح في الحصول على مصل مضاد على درجة عالية من التخصص لفيروس ما يتوقف على مدى نجاح تنقية هذا الفيروس من الشوائب النباتية الموجودة في العصير المستخلص من النبات المصاب. ويستخدم في الوقت الحالي طرقا عديدة لتنقية الفيروسات. تجميد الأوراق المصابة قبل تقطيعها وفرمها لاستخلاص العصير أو تسخين عصير النباتات المصابة في حمام مائي على 50-60 °م لمدة 5 دقائق أو استخدام المركبات الكيماوية غير القطبية (الكلوروفورم والبيوتانول وغيرها) أو غيرها يؤدي إلى تجميع المواد البروتينية النباتية coagulation ذات الصفات الأنتيجينية مما يسهل التخلص منها باستخدام جهاز الطرد المركزي ذات السرعة المنخفضة. تحضيرات الفيروس النقية بعد ذلك يمكن الحصول عليها بطرق عديدة منها طريقة الترسيب عند نقطة التعادل الكهربائي والطرد المركزي المفرق وكذلك الطرد المركزي في محاليل متدرجة الكثافة.

يمكن استخدام أنواع عديدة من الحيوانات مثل الارانب والفئران وخنازير غينيا والحصان لإنتاج أمصال مضادة للفيروسات النباتية. أكثر هذه الحيوانات استخداما هي الأرانب لسهولة الحصول عليها وسهولة حقنها كما أنها ذات حجم مناسب، وبالتالي يمكن الحصول على كميات مناسبة من الأمصال، علاوة على ذلك فان الأمصال المضادة الناتجة منها تعطي ترسيب جيد مع الفيروس المستخدم في الحقن. وتحقن الأرانب بالفيروس بالطرق التالية:-

١- الحقن في العرق Intravenous injection:

تفضل هذه الطريقة في الحقن حيث يعتقد انها تعطي كمية كبيرة من الاجسام المضادة عن الطرق الأخرى. وتستخدم مع التحضيرات الفيروسية النقية كما يمكن استخدامها أيضا مع التحضيرات الفيروسية غير النقية وذلك في حالة ما إذا ما كانت خالية من المواد السامة للأرانب.

يستخدم لهذا الغرض محاقن ذات ابره حادة ويفضل رقم ۲۰ أو ۲۲ . ينظف المحقن جيدا ثم تسحب كمية الفيروس المراد حقنها بشرط الا يحتوي المحقن على اية فقاعات هوائية. تنظف الأذن بكحول ايثيل ۷۰% تنظيفا جيدا. وهذا يسبب وضوح العرق المراد استعماله في الحقن. يجري الحقن في اتجاه قاعدة الأذن في العرق الموجود على السطح العلوي الأذن من الناحية الخارجية وعلى بعد 3-4 مم من الحافه. بعد اتمام الحقن يضغط على مكان دخول الإبرة ثم تسحب ويستمر الضغط قليلا لمنع حدوث نزيف. عند تكرار مرات الحقن تبدأ الحقنات من طرف الأذن إلى قاعدتها.

2- الحقن تحت الجلد subcutaneous injection:

طريقة سهلة في الحقن. تنظف منطقة الحقن وتختار بحيث يكون الجلد سهل الشد. بإحدى اليدين بشد الجلد إلى أعلى وباليد الأخرى يحقن الفيروس. تستخدم هذه الطريقة وكذلك الحقن في العضل في حالة احتواء التحضير الفيروسي على مواد سامة يصعب التخلص منها. ويمكن استخدام مواد مساعدة تخلط مع التحضير مثل الزيوت المعدنية واللانولين lanolin، فيحضر مخلوط من الزيت المعدني 17 Risella واللانولين ثم يؤخذ حجم من هذ الخليط ويضاف إلى حجم من التحضير الفيروسي ثم يحقن تحت الجلد بمقدار 1 سم³ في المرة الواحدة.

نظام الحقن:

تعتمد الطريقة التي تتبع في حقن الأرانب على الآتي:

1- كلية التحضير الفيروسي المستعملة في الحقن ونوعيتها.

2- احتواء التحضير الفيروسي على مواد سامه للأرانب من عدمه.

3- الغرض الذي تستعمل فيه الأمصال المضادة.

فمثلا في حالة انتاج الأمصال العالية التركيز مثل الأمصال لفيروس موزايك الدخان فان عدد مرات الحقن تبلغ 3-6 مرات أسبوعيا وكل جرعة من ۱-۱۰ مجم فيروس وتزداد الجرعات تدريجيا. وفي حالة ما إذا كانت كمية التحضير الفيروسي النقي صغيرة تعطي الجرعات بكميات صغيرة وعلى دفعات عديدة وذلك أفضل من إعطاء كميات كبيرة على دفعات قليلة. وعموما يجري الحقن في الأرانب كل ۲-۳ أيام بجرعات صغيرة في حالة التحضيرات الفيروسية النقية تبدأ من ۱ سم³ وتزداد إلى أن تصل إلى 5 سم³ ويجري الحقن في العرق.

أما في حالة التحضيرات الفيروسية غير النقية التي تحتوي على مواد سامه للأرانب فيجري الحقن في العضل أو تحت الجلد بجرعات تبدأ من ۲ سم2 وتزداد إلى ۱۰ سم³. عدد مرات الحقن من 5-10 حقنات. تجرى عملية فصد الحيوان بعد 9 - 14 يوم من تاريخ آخر حقنه.

عملية الفصد:

تجرى عملية الفصد في الأذن التي لم تستعمل في الحقن. تنظف الأذن بالكحول ثم تدعك بكمية من الزايلين Xylene وذلك يزيد من كفاءة العملية. ويعمل جرح صغير في العزق الأساسي للأذن بجوار القاعدة بواسطة شفرة حلاقه حاده. ثم يجمع الدم في أنابيب معقمة ويراعي الحذر الشديد حتى لا يحدث تكسير في كرات الدم وبالتالي يتلون المصل بلون أحمر ولهذا يستقبل الدم على جدار الأنبوبة برفق. بعد جمع الدم يوقف النزيف بحبس مكان الجرح أو تغطيته بطبقه من الكلوديون مذابة في كحول ايثايل. يترك الدم في الأنابيب ساكنا عدة ساعات على درجة حرارة الغرفة أو ساعتين على 37 م ثم يفصل عن جدار الأنبوبة بواسطة ساق زجاجية معقمة. ويحفظ بعد ذلك في الثلاجة على 4م لمدة ۱۲ ساعة. يفصل المصل عن باقي مكونات الدم المتخثرة وتجرى له عملية طرد مركزي لمدة 10 دقائق على سرعة 2000-3000 لفة في الدقيقة للتخلص من أي بقايا المكونات الدم الاخرى.

تجرى عملية الفصد من ۲ - ۳ مرات في فترة ثلاثة أيام متتالية وتصل كمية الدم التي تجمع من الارنب الواحد حوالي 50 - 150 سم3. الارنب المستعمل يمكن استخدامه لنفس الفيروس بعد عدة أسابيع كما يمكن استعماله لفيروسات أخرى بعد فترة راحة تزيد عن 4 شهور. كثرة استخدام الأرنب تزيد من عناية المصل الناتج وذلك لوجود بعض المواد الدهنية به ولكنها لا تؤثر على كفاءة التفاعل.

تخزين المصل:

المصل المحضر بالطريقة السابقة غير معقم ويمكن أن يتلف إذا لم يحفظ بطريقة تمنع نمو البكتريا. أنسب طريقة لحفظ الأمصال هو تقسيمها إلى كميات صغيرة 5-20 سم3 في أنابيب وتجميدها. يراعى خلط كمية المصل جيدا قبل تقسيمها في الأنابيب الصغيرة. في حالة عدم إمكانية تجميد المصل يجب أن يضاف إليه عدة نقط من الفينول أو الثيمول أو الكلوروفورم وهي مواد تمنع نمو الميكروبات في المصل. وعموما يستعمل التجميد الجاف أو التفجيد بكفاءة عالية لحفظ الأمصال.

بعض أنواع الطرق السيرولوجية المتبعة مع الفيروسات النباتية

١- تفاعل الترسيب Precipitation reaction :

من أكثر الطرق استخداما بالنسبة للفيروسات النباتية. عن طريقه يمكن ملاحظة الراسب الخاص الذي يتكون نتيجة التفاعل الانتيدين مع الأجسام المضادة. يستخدم اصطلاح الترسيب precipitation للتعبير عن التفاعل الذي يؤدي إلى حدوث ترسيب ناتج عن اتحاد الأنتيجينات الجزيئية مثل البروتينات أو عديدات التسكر مع الاجسام المضادة الخاصة بها. أما اصطلاح التلبد أو التجمع agglutination فيطلق على التفاعلات التي يدخل في تكوين رواسبها أنتيجينات خلوية مثل البكتريا. الفيروسات النباتية تحتل مركزا وسطيا من حيث حجمها بين الخلايا والبروتينات الصغيرة ولهذا فان التفاعل بين الفيروسات النباتية والأجسام المضادة يحتل مركزا وسطيا بين اختباري التلبد والترسيب ولكن غالبا ما يطلق على الاختبارات التي تتم على الفيروسات النباتية باسم اختبارات الترسيب.

الأنتيجين الفيروسي يرتبط بالعديد من جزيئات الأجسام المضادة البروتينية أي أنه polyvalent. عدد الاجسام المضادة المرتبطة يعتمد على حجم الأنتيجين الفيروس، أما الجسم المضاد فيرتبط بجزيئين فيروسين فقط بمعنى انه divalent. يرتبط الأنتيجين الفيروسي بالأجسام المضادة مكونا شكلا ذات تركيب شبكي يكبر في الحجم ثم يرسب. يختلف مظهر الراسب باختلاف شكل الفيروس، فالفيروسات العضوية مثل فيروس موزايك الدخان وفيروس × البطاطس تعطي راسب زغبي بينما الفيروسات الكروية تعطي راسب كثيف حبيبي. يمكن ملاحظة الراسب بعدة طرق:

(أ) الترسيب في أنابيب Precipitation in tubes:

يجري هذا الاختبار في أنابيب صغيرة حيث يوضع 12-۱ سم3 من التحضير الفيروسي ثم يضاف إليها نفس الحجم من المصل المضاد ويخلطان جيدا، وتترك الانابيب في حمام مائي على درجة 37-50 م حسب الفيروس المختبر. يؤثر على نتائج تفاعل الترسيب عدة عوامل منها:

١- تركيز الفيروس والمصل المضاد:

إن تركيز الفيروس والمصل المضاد من العوامل الهامة التي تؤثر على سرعة حدوث الترسيب وكذلك كمية الراسب وامكانية حدوث الترسيب من عدمه. فقد بمنع تكوين الراسب نتيجة لزيادة تركيز الفيروس أو المصل المضاد عن حد معين، ولذا يجب عمل المخلوط بنسب مختلفة أو تركيزات مختلفة حتى يمكن التأكد من أن غياب الراسب لا يرجع إلى زيادة تركيز أي من مكونات الخليط (الفيروس أو المصل المضاد). وعلى سبيل المثال يمكن عمل سلسلة من تخفيفات الفيروس 1:1 ، 1 : 2 ، 1 : 4 وهكذا في عدد من الأنابيب ثم يضاف إليها كميات متساوية من المصل المضاد ذات تخفيف واحد. في هذه الحالة ممكن معرفة درجة تخفيف الفيروس والتي عندها يحدث تفاعل الترسيب بأسرع ما يمكن. عند التخفيفات الأدنى والأعلى من هذا التخفيف فان تفاعل الترسيب يتم ببطه شديد أو قد لا يتم. لو حسبنا الوقت اللازم لحدوث الترسيب لكل تخفيف بالدقيقة عند استخدام مصل مضاد ذات تخفيف 1 : 16 فأننا نحصل على نتائج تماثل نتائج المثال التالي:

تخفيف الفيروس 1:1 ، 1 : 2 ، 1 : 4 ، 1 : 8 ، 1 : 16 ، 1 : 32 ، 1 : 64

الوقت اللازم لظهور

الترسيب (دقيقه) 100        10    12   1      3      30    100

كمية الراسب النسبية o       +++++++++++ +       ±        o

نسب مكونات التفاعل والتي تعطي أسرع ترسيب يطلق عليها ألفا المثالية optimum - α . عند هذه النسبة تظهر أكبر كمية من الراسب. كمية الراسب النسبية المتحصل عليها باستخدام تخفيفات مختلفة لمواد التفاعل يمكن التعبير عنها في صورة عدد من علامات +.

لكل من الفيروس والمصل المضاد درجة تخفيف بعدها لا يحدث ترسيب مرئي وتسمى في حالة الفيروس بدرجة التخفيف النهائية أما في حالة المصل المضاد فيطلق عليها تايتر المصل المضاد antiserum titer.

2- وجود الأملاح:

لا يحدث ترسيب في الوسط ذو القوة الأيونية الضعيفة. وعموما فإن تخفيف المواد الداخلة في التفاعل لابد وأن يتم باستخدام محلول فسيولوجي من كلوريد الصوديوم 85ر%، إذ أن وجود الأملاح ضروري لظهور التفاعل وكذلك لحفظ بعض بروتينات المصل.

3- درجة الحرارة:

كلما ارتفعت درجة الحرارة كلما أسرع ذلك من حدوث التفاعل بين الأنتيجين، والأجسام المضادة ولكن ذلك يعتمد على درجة ثبات الفيروس. ففي حالة الفيروسات التي تحمل درجة الحرارة المرتفعة مثل فيروس موزايك الدخان فان التفاعل ممكن إجراؤه على درجة حرارة 50م. أما في حاله الفيروسات غير الثابتة والتي تؤثر فيها درجة الحرارة المرتفعة فيمكن إجراء التفاعل على درجة حرارة بين 20 - 37م.

4- رقم pH الوسط:

عموما يجرى اختبار الترسيب بدون إضافة محاليل منظمة ولكن بعض الحالات تتطلب pH معين في حدود من 6 - 9. إلا أن أغلب الفيروسات تعطي تفاعل جيد عند  = pH  ۷.

5- درجة الخلط:

تعتمد سرعة الترسيب على درجة خلط مكونات التفاعل وخاصة في حالة استعمال أنتيجينات مركزة مع أمصال مضادة مخففة. في هذه الحالة إذا لم تخلط المواد المتفاعلة جيدا فان الترسيب الضعيف الذي يتكون سرعان ما يختفي عند حفظه لمدة صغيرة. عند وضع الأنابيب في الحمام المائي يجب أن تغمر بحيث يكون نصف حجم المحلول تحت سطح الماء والنصف الآخر فوق سطح الماء وهذا يسمح باستمرار الحركة في المحلول ويزيد من كفاءة الترسيب.

(ب) اختبار الترسيب الحلقي Ring interface precipitation test

يجري هذا الاختبار في أنابيب صغيرة ذات قطر ۲-۳ ملليمتر ويوضع بها 1ر- 2ر سم3 من المصل المضاد المركز بدون تخفيف أو بتخفيف لا يزيد عن ۱: ۲. يضاف للمصل المضاد نفس الحجم من التحضير الفيروسي بتخفيفات مختلفة وذلك بحذر شديد حتى لا يختلط. التحضير الفيروسي بالمصل المضاد. لو كان للانتجين وزن نوعي أكبر من الوزن النوعي للمصل المضاد فيجب عمل العكس إذ يوضع اولا الأنتجين ثم يضاف إليه المصل المضاد او يستخدم المصل المضاد المخفف بالجلسرين بنسبة ۱: ۱.

بالقرب من سطح تلامس المحلولين فان الأجسام المضادة تنتشر خلال التحضير الفيروسي وكذلك فان الجزيئات الفيروسية تنتشر أيضا خلال طبقة المصل المضاد. في مكان ما داخل حدود تلك المنطقة الضيقة فان نسب مكونات الخليط مبكرة أو مؤخرة سوف تكون ملائمة لتكوين راسب في تلك الحالة على السطح الفاصل بين التحضير الفيروسي والمصل المضاد أو بالقرب منه تظهر حلقة أو قرص من الراسب. لابد من استخدام أنابيب للمقارنة تحتوى على مصل عادي. يجري هذا التفاعل في العادة تحت ظروف درجة حرارة الغرفة.

 (ج) اختبار الترسيب الدقيق Microprecipitation test :

يستخدم في هذا الاختبار أطباق بترى جافة يغطي قاعها بمادة غير محبة للماء hydrophopic material وهي غالبا ما تكون فورمفار Formvar وذلك عن طريق وضع كمية منها في قاع الطبق ثم تفرغ تاركة طبقة رقيقة تترك لتجف عدة ساعات فتكون غشاء على قاع الطبق. توضع أطباق بترى على ورقة مربعات 8 × 8 سم ثم توضع نقطة من المصل المضاد في كل مربع من المربعات ويضاف اليها نقط مائلة من التحضير الفيروسي. طبقة الفورمفار تعمل على منع انتشار النقطة الموجودة بمربع إلى مربع آخر.

بعد وضع نقط من التحضير الفيروسي على نقط المصل وخلطهم يصب زيت البرافين في الطبق بحيث يغطي جميع النقط. يلاحظ تكوين الراسب الممكن مشاهدته بواسطة عدسة يدوية أو تحت القوة الصغرى للميكروسكوب الضوئي. بهذه الطريقة يمكن إجراء حوالى من 40 – 60 اختبار في الطبق الواحد.

(د) تفاعل الترسيب في الآجار precipitation reaction in agar:

خلال السنوات القليلة الماضية زاد استخدام طرق الترسيب في الآجار أو الجلي وتتميز تلك الطرق بالخواص الاتية:

1- العمل على الفصل الطبيعي لمخاليط جزيئات الأنتجينات وكذلك الأجسام المضادة، وذلك باستغلال الاختلاف في معدل انتشارها في الآجار أو الجلي أن الاختلاف في معدل تحركها في وجود وسط كهربائي - immunoelectro phoresis أو للاثنين معا.

2- مقارنة الأنتيجينات المختلفة ببعضها البعض تحت ظروف واحدة.

توجد عدة طرق للانتشار أو الترسيب في الآجار نذكر منها الانتشار الثنائي بطريقة اوشترلوني Ouchterlony agar double diffusion test وهو كالتالي: تضاف كمية من الآجار بنسبة 7ر-1% إلى محلول منظم ثم تسخن لدرجة 92 في حمام مائي لإذابة الآجار إذابة تامة، وبعد تبريده لدرجة 60م يضاف الية مادة sodium azid وتقلب جيدا بحيث يصل تركيزها في المحلول 1ر% وذلك لمنع نمو الميكروبات في الآجار. نوع ورقم pH المحلول المنظم يعتمد على درجة ثبات الفيروس وخواصه. عموما فان درجة pH المثلى لأغلب الفيروسات هي 3ر7. قد يضاف ميثيل أورانج methyl orange لزيادة ظهور الترسيب المتكون.

يصب الآجار في أطباق بترى بسمك 2-3 سم وبعد أن يتجمد تعمل فيه ثقوب بواسطة ثاقبات خاصة يحدد عددها حسب الاختبارات المطلوبة يفضل أن تحدد الثقوب قبل صب الآجار وذلك بوضع أعمدة أسطوانية يمكن التحكم في عددها وارتفاعها في الطبق قبل صب الآجار بحيث لا تصل الثقوب إلى قاع الطبق حتى لا يخشى من تسرب المحاليل في المسافات بين قاع الطبق والآجار بدلا من انتشارها خلال الآجار نفسه وهو المطلوب.

عادة في الثقوب الوسطية يوضع المصل المضاد للفيروس. أما في الثقوب المحيطة فيوضع التحضير الفيروسي. ينتشر الفيروس والأجسام المضادة خلال طبقة الآجار في اتجاهين متضادين. في منطقة التقابل والتي يكون فيها نسبة كل منها إلى الآخر ملائما يتكون شريط الترسيب. إذا كان أحد التحضيرات المستخدمة لا تحتوى على الفيروس أو تحتوي على فيروس مختلف عن الفيروس الذي حضر له المصل المضاد فان شريط الترسيب في المنطقة الفاصلة والمقابلة لذلك الثقب الذي لا يحتوي على الفيروس أو يحتوي على الفيروس المختلف لن يظهر. إذا احتوت التحضيرات على أنتجين واحد فإن أشرطة الترسيب تتحد مكونة كونتور contour متصل. تظهر أشرطة الترسيب عادة بعد 2-6 أيام على درجة ۲۰م.

يستخدم هذا التفاعل بكفاءة عالية في حالة الفيروسات الكروية عنه في حالة الفيروسات العصوية أو الخيطية لصعوبة انتشارها في الآجار، وحديثا أمكن التغلب على هذه المشكلة بتجزئة الفيروسات الحصرية أو الخيطية إلى أجزاء صغيرة يسهل انتشارها في الآجار.

II- اختبار التلبد أو التجمع Agglutination test:

كما عرفنا سابقا أن الراسب المرأي الذي يتكون عند خلط الفيروسات النباتية بالأمصال المضادة لها يطلق عليه تفاعل الترسيب. ولكن إذا ما أخذت نقطة من عصير نباتي يحتوي على كمية مناسبة من الفيروس وخلطت مع المصل المضاد له على شريحة زجاجية فانه دائما ما يلاحظ تجمع clumping للجزيئات الصغيرة النباتية والتي يحتويها العصير. وبالرغم من أنه لا يدخل في هذا التفاعل الاجسام المضادة لتلك الجزيئات النباتية الصغيرة إلا أن هذا التفاعل يطلق عليه تفاعل التلبد أو التجمع. ربما يرجع ذلك إلى التشابه في المظهر العام مع مظهر تلبد أو تجمع البكتريا بواسطة المصل المضاد لها.

يجرى هذا الاختبار بوضع نقطة من عصير النبات المراد الكشف عنه على كل طرف من طرفي شريحة زجاجيه ثم يضاف إلى إحدى النقطتين نقطة من المصل المضاد للفيروس المطلوب الكشف عنه ويضاف إلى النقطة الأخرى نقطة من المصل العادي وتستخدم للمقارنة. تخلط كل نقطة جيدة مع نقطة المصل عن طريق التقليب بطرف شريحة زجاجية أخرى أو قضيب زجاجي ثم تفحص. يمكن زيادة الرؤية بوضع مرآة أسفل الشريحة لتوجيه الأشعة الضوئية إلى مركز النقطة وعندئذ يمكن رؤية التلبد أو التجمع إذا كان النبات مصابا بالفعل بذلك الفيروس المحضر له المصل المضاد الذي استخدم في الاختبار. أما المقارنة فلن يظهر فيها أي تلبد وذلك في حالة سلامة الاختبار.

III- اختبار تثبيت المعمل Complement fixation test

باستخدام هذه الطريقة يمكن معرفة حدوث اتحاد بين الأنتجين والأجسام المضادة من عدمه حتى ولو كان في المحلول كميات قليلة من الفيروس أو آثار منه. نتائج التفاعل لا تظهر في صورة راسب ولكنها تعرف بطريقة غير مباشرة تعتمد على أن اتحاد الأنتجين مع الأجسام المضادة يوقف تفاعل آخر وهو تحلل كرات الدم الحمراء للأغنام بواسطة المصل المضاد المتحصل عليه نتيجة لحقن الأرانب بدم الأغنام. يطلق على المصل المضاد لكرات الدم الحمراء اسم محلل كرات الدم الحمراء haemolytic amboceptor. تحلل كرات الدم الحمراء يتم عند وجود عنصرين أساسيين:

١- الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء.

۲- مرافق أو مكمل وهو مادة غير متصصة لا تتحمل درجات الحرارة المرتفعة وتوجد في سيرم الدم.

اتحاد الانتجين بالأجسام المضادة يعمل على تثبيت المادة المكملة. كلما زادت كمية الأنتيجين والأجسام المضادة المتفاعلة كلما زادت كمية المادة المكملة المثبتة أو المرتبطة.

عند إضافة كرات الدم الحمراء ومحلل كرات الدم الحمراء إلى أنبوبة تحتوي على خليط الأنتجين والمصل المضاد والمادة المكملة فان درجة تحلل كرات الدم الحمراء يختلف باختلاف كمية المادة المكملة الحرة والتي لم يحدث لها تثبيت أو ارتباط. لا يحدث التحلل إطلاقا إذا حدث تثبيت كلى للمادة المكملة.

يدخل في التفاعل ۱- الأنتجين الفيروسي. ۲- المصل المضاد للفيروس بعد تعرضه لدرجة 56 م لتثبيط المكمل. ۳- كرات الدم الحمراء للأغنام والمغسولة في محلول فسيولوجي. 4- محلل كرات الدم الحمراء أو المصل المضاد بعد تعريضه لدرجة 56 لتثبيط المكمل. 5- مكمل قياسي مأخوذ من مصل طازج لخنازير غينيا.

عند إجراء هذا التفاعل يخلط أولا الأنتيجين الفيروسي مع الأجسام المضادة له ثم تضاف كمية معلومة من المادة المكملة بوضع المخلوط على درجة ۳۷° لمدة ساعة حتى يتحد الأنتجين مع الاجسام المضادة له ويحدث تثبيت للمكمل، ثم تضاف كرات الدم الحمراء ومحلل كرات الدم الحمراء. يوضع المخلوط مرة أخرى على درجة ۳۷ م. بعد فترة من الزمن يحدد درجة تحلل كرات الدم الحمراء عن طريق درجة تلون المحلول بالهيموجلوبين. إذا كان تركيز الانتجين عالي نسبيا والمكمل قد ثبت كليا فان المخلوط سوف يظل عديم اللون في حالة غياب الانتجين فإن المخلوط يتلون باللون الأحمر (هيموجلوبين). عند وجود كميات بسيطة من الأنتجين فان درجة تلون المخلوط تختلف.

تعتبر هذه الطريقة من أكثر الطرق حساسية بالنسبة لبعض الفيروسات النباتية ولكنها لا تستخدم بكثرة لصعوبتها.

توجد بعض الطرق الأخرى التي نادرا ما تستخدم مع الفيروسات النباتية ومنها اختبار الحساسية anaphylaxis.

المجاميع الانتيجينية للفيروسات

التركيب الانتيجيني للفيروسات معقد جدا. سلالات الفيروس الواحد وكذلك الفيروسات المقاربة تملك مجاميع محددة أنتيجينية متشابه كما يملك كل منها أيضا مجاميع انتيجينية خاصة به عن طريقها يمكن تمييزهم سيرولوجيا.

المصل المحضر لانتيجين معين وليكن مثلا لسلاله معينه لفيروس ما يطلق عليه homologous antiserum وذلك بالنسبة للانتيجين الذي حضر من أجله هذا المصل المضاد. المصل المضاد المحضر لانتجين آخر قريب للانتدجين الأول او لا يمت إليه بصلة قرابة يطلق عليه heterologous antiserum، أما اصطلاح التفاعل التبادلي cross reaction فيطلق على التفاعل الذي يتم بين انتيجين واجسام مضادة في مصل مضاد محضر لانتيجين آخر heterologous antiserum إذا تفاعل المصل المضاد المحضر لفيروس A مع فيروس B فهذا يعني أن بعض المجاميع الأنتيجينية الموجودة على سطح الفيروس B متشابهة مع المجاميع التي تقابلها على سطح الفيروس A ويعرف هذين الفيروسين بأنهما متقاربان سيرولوجيا.

نفترض أنه يوجد على سطح انتيجين ما مجموعتان محددتان انتيجينيتان antigenic determination groups ولتكن B و A . المصل المضاد لهذا الأنتيجين لابد وان يحتوي على أجسام مضادة خاصة للمجموعة A واجسام مضادة أخرى خاصة للمجموعة B. إذا وجد فيروسان ولم يتفاعل أي منهما مع المصل المضاد المحضر للفيروس الآخر يمكن القول أنه على سطوح هذين الفيروسين لا توجد مجاميع انتيجينية متشابهة لها القدرة على تشجيع انتاج أجسام مضادة في جسم الحيوان تشترك في التفاعل التبادلي. يطلق على هذين الفيروسين أنهما غير قريبين سيرولوجيا.

إذا ارتبط أحد الفيروسات مع كل الاجسام المضادة الموجودة في المصل المضاد المحضر لفيروس ثاني، وارتبط الفيروس الثاني مع كل الأجسام المضادة الموجودة في المصل المضاد المحضر للفيروس الأول فانه يطلق على مثل تلك الفيروسات أنها متطابقة سيرولوجيا.

إذا تشابهت بعض المجاميع الأنتيجينية الموجودة على سطح أحد الفيروسات مع مثيلتها على سطح فيروس آخر، فان كل فيروس سوف يتفاعل بدرجة ما مع المصل المضاد للفيروس الآخر. ونظرا لاحتواه كل فيروس على مجاميع أنتيجينية أخرى خاصة به فان المصل المضاد لأي منهما سوف يحتوى على أجسام مضادة أخرى لها القدرة على أن تتفاعل فقط مع الفيروس الذي أدى إلى تكوينها. وعلى هذا الأساس يمكن أن توجد درجات مختلفة من القرابة السيرولوجية. وطريقة الامتصاص المتبادل cross absorption test هي الطريقة الأساسية الي يمكن استخدامها لإظهار مدى الاختلافات في درجة القرابة السيرولوجية.

ولإيضاح ذلك ببساطة نفترض ان لفيروس ما سلالتين يحتويان على مجاميع انتيجينية متشابه وأخرى مختلفة. التركيب الانتيجيني للسلالة الأولى يمكن التعبير عنه بالحروف X , Y والسلالة الثانية بالحروف Z , X . نتيجة لذلك فان المصل المضاد للسلالة الأولى لابد وأن يحتوي على الأجسام المضادة Y₁ , X₁ ، بينما المصل المضاد للسلالة الثانية لابد وأن يحتوي على الأجسام المضادة Y₁ , X₁. لو خلط المصل المضاد للسلالة الثانية بأنتيجين السلالة الأولى فان الاجسام المضادة X₁ سوف ترتبط بالفيروس مكونة راسب.

بينما الأجسام المضادة Z₁ سوف تظل حره في المخلوط وذلك لغياب المجامع الأنتيجينية Z. لو فصل الراسب باستخدام قوى الطرد المركزية وأخذ المحلول الرائق. أضيف إليه انتيجين السلالة الثانية فان الاجسام المضادة الحرة Z₁ والموجودة في المحلول سوف تتفاعل مع انتجين السلالة الثانية مؤدية إلى تكوين راسب جديد.

أوجه استخدامات الطرق السيرولوجية

١. تعريف الفيروسات:

عند وجود الإمكانيات لتحضير أمصال مضادة للعديد من الفيروسات المختلفة فإنه يمكن بواسطة الطرق السيرولوجية التعرف بسهولة وسرعة على الفيروس في فترة وجيزة لا تتعدى أجزاء من الدقيقة بعكس الطرق البيولوجية التي تحتاج إلى وقت طويل وبجهود كبير وادوات خاصة. ولهذا تنتشر طريقة التشخيص السيرولوجي انتشارا كبيرا، كما يمكن بواسطتها الكشف عن الاصابات الكامنة. وتستخدم هذه الطريقة بنجاح في الحمل على تقاوي بطاطس خالية من الفيروس.

٢- تقسيم الفيروسات إلى مجاميع سيرولوجية:

باستخدام الطرق السيرولوجية يمكن تقدير درجة القرابة بين الفيروسات التي تعطي أعراضا مختلفة على النباتات وحتى بين الفيروسات التي لا تشترك مع بعضها في عائل نباتي عام. وبالتالي أمكن وضع الفيروسات القريبة سيرولوجيا في مجاميع منفصلة. كما يمكن استخدام هذه الطرق ايضا لأثبات أن الأعراض المتشابهة لمرضين تتسبب عن فيروسات غير قريبة سيرولوجيا.

3- تقدير درجة العلاقة بين سلالات الفيروس.

4- دراسة انتشار المرض داخل النبات وتقدير تركيز الفيروس.

5- تنقية الفيروسات وكذلك في الكشف عن مدى نقاوة التحضير الفيروسي.

6- معرفة أماكن وجود الفيروس في الخليه.

ويتم ذلك في بعض الحالات باستخدام أجسام مضادة مرتبطة بجزيئات ذات خواص فلوروسنتيه، وباستعمال هذه الطريقة أمكن معرفة أن بروتين فيروس موزايك الدخان يتراكم في السيتوبلازم ولا يوجد في النواه.