استخدام طرق زراعة الانسجة في تربية النبات

ان طريقة زراعة الانسجة قد اعانت مربي النباتات واختصرت سبل انتاج نباتات واصناف جديدة وخاصة في بعض النباتات مثل محاصيل الزينة والخضر وبعض انواع الحبوب، فمن المعروف انه باستخدام طرق التربية التقليدية المتبعة حاليا يتم انتاج صنف جديد خلال ۸-۱۰ سنوات، بينها باستخدام زراعة الانسجة يمكن اختصار هذا الزمن الى النصف ويتم ذلك بعدة طرق اهمها:

1- استخدام طرق زراعة المتوك anthers وحبوب اللقاح polleng grains لإنتاج نباتات تحمل العدد النصفي من الكروموسومات (1N) لإنتاج نباتات نقية تدخل في برامج التربية اختصارا للوقت.

2- انتاج الهجن للتغلب على مشاكل العقم في بعض الاصناف.

3- زراعة الاجنة النيوسيلية لإنتاج نباتات مشابهة للإباء.

4- انتاج طفرات وراثية بتعريض الانسجة الى مواد مطفرة اما كيماوية او بالإشعاع ثم الانتقاء لما هو مفيد.

5- استخدام طريقة protoplast fusion لإنتاج هجن جديدة.

6- زراعة وانقاذ الاجنةembryo rescue .

7- البذور الصناعية artificial seeds (synthetic seeds)

8- نقل صفات وراثية محددة خلال ما يعرف بالهندسة الوراثية.

زراعة المتوك

يقوم مربي النبات خلال برامج التربية التقليدية بالحصول على نباتات احادية المجموعة الكروموسومية (N) وتستغرق هذه الطريقة للحصول على صنف نقى عدة سنوات ومجهود مضن ووقت طويل بالإضافة الى التكلفة المادية. ولكن عند استخدام تقنية زراعة المتوك او حبوب اللقاح يؤدي ذلك الى انتاج نباتات احادية المجموعة الكروموسومية بطريقة سريعة وسهلة ولا تحتاج الى امكانيات كبيرة عند تطبيقها وذلك بالمقارنة مع الطرق التقليدية التي يتبعها مربي النبات. وقد تم الاستفادة من هذه التقنية في العديد من الاصناف النباتية مثل: الارز والقمح والدخان والقطن وفول الصويا وغيرها من النباتات

 (Gresshoff, 1972, Chu, 1978,Collins, and Genovesi 1982)

والهدف النهائي لتطبيق هذه الطريقة هو الحصول على نباتات نقية homozygous والتي تدخل بدورها في برامج التحسين الوراثي ويمكن ايضا الحصول على قوة الهجين من خلالها.

ومن الناحية التاريخية يجب ان نذكر البحوث التي قدمها كل من العلماء

Niitsch and, Nitsch, 1969; Guha and Maheshwari1964

في ارساء هذه التقنية الهامة. وتتميز طرق زراعة المتك في المعمل ببساطتها وكفاءتها العالية في انتاج نباتات احادية وبالطبع هذه النباتات تختلف عن النباتات الاصلية وراثيا ومظهريا عن نباتات الام التي تم فصل النسيج منها. وهنا يجب ان نذكر ان المتك يتكون من نوعين من الانسجة، النسيج الاول هو الغلاف وتركيب خلاياه يحتوي على مجموعة متضاعفة من الكروموسومات (2N) وهي متشابهة للخلايا الجسمية الأخرى المكونة للنبات الام، اما حبوب اللقاح pollen grains الموجودة داخل الغلاف فهي احادية المجموعة الكروموسومية (1N).

تتكون الاجنة الذكرية بطريقة مباشرة direct embryogenesis حيث تنتج اجنة احادية العدد الكروموسومي مباشرة من حبوب اللقاح بدون الدخول في مرحلة تكوين الكالوس وبعد عدة اسابيع تظهر الاجنة في صورة نموات صغيرة تتكشف عن نباتات احادية العدد الكروموسومي.

وقد تنشا بطريقة غير مباشرة indirect embryogenesis حيث يتكون كالوس احادي العدد الكروموسومي من حبوب اللقاح وذلك بكمية قليلة جدا ثم يتكشف الكالوس الى اجنة احادية ينتج عنه نباتات احادية. ومن الجدير بالذكر انه يمكن انتاج نباتات ذات عدد زوجي من الكروموسومات خلال مضاعفة العدد الكروموسومي باستخدام مواد كيميائية مثل الكولشسين (cholchicine).

 تستخدم عدة بيئات لزراعة المتك منها (White .1963 and Nitsch and Nitsch1969) الا انه يمكن عمل اجراء تعديل لهذه البيئات حسب نوع النبات المستخدم فمثلا تركيز السكر قد يزداد قليلا في حالة متك الذرة عن استخدام متك القمح وان وجود الفحم النباتي النشط قد يؤدي في بعض الاحيان الى انتاج اعداد وفيرة من النباتات لقدرته على ادمصاص المركبات السامة المثبطة للنمو التي قد يفرزها المتك. كما ان الفحم النباتي يقوم بتنظيم امتصاص منظمات النمو الداخلية في النسيج والخارجية التي تضاف الى البيئة.

هناك عوامل تؤثر على تكوين الاجنة الذكرية منها عمر النبات والمرحلة الفسيولوجية المتك المفصولة من نباتات حديثة العمر وفي بداية موسم التزهير تكون مناسبة اكثر من المتك المفصولة من نباتات متقدمة في العمر.

من اهم المعاملات ما قبل الزراعة والتي تشجع على embryogenesis هي تعريض البراعم الزهرية المحتوية على المتوك الى درجة حرارة منخفضة (3-5م) لمدة لا تتعدى 72 ساعة وذلك قبل استعمال البراعم في الزراعة. كما ان حفظ الزراعات في بعض الاحيان في الظلام لفترة معينة او حتى في الضوء الخافت يساعد ذلك على زيادة عدد الاجنة المتكونة وقد لوحظ ايضا ان اضافة الفحم النباتي الى بيئة المتوك لنبات الدخان ادى الى زيادة في عدد الاجنة من 15–45 ٪ في بعض الاصناف وقد وصل الى 90 ٪ في اصناف اخرى وايضا ادى الى سرعة نموها(Gresshoff, 1972 and Chu, 1978) .

خطوات انتاج نباتات احادية المجموعة الكروموسومية – زراعة المتوك

1- اختيار البراعم الزهرية في بداية موسم الازهار والمعاملة بدرجة الحرارة المنخفضة.

2- فصل المتوك من البرعم الزهري.

3- زراعه المتوك على بيئة ملائمة.

4- يحدث تكشف للأنسجة المزروعة.

5- تكشف مباشر حيث يبدا في الظهور اجنه جسمية ثم تطورها الى نباتات صغيرة احادية المجموعة الكروموسوميه  .N

6- تفصل هذه النباتات الصغيرة وتنقل الى بيئة جديدة.

7- تعامل النباتات بمادة الكولشسين للحصول على نباتات ثنائية المجموعة الكروموسومية 2N.

8- تكشف غير مباشر حيث يبدا في الظهور نسيج الكالوس وتضخمه ليتكشف عنه نباتات صغيرة.

9- تفصل هذه النباتات الصغيرة وتنقل الى بيئة جديد.

10- تعامل النباتات بمادة الكولشسين للحصول على نباتات نقية ثنائية المجموعة الكروموسومية 2N.

انتاج سلالات منتخبة

سوف نذكر هنا كيفية الاستفادة من تطبيقات زراعة الانسجة في انتاج سلالات منتخبة جديدة من النباتات. فمن المعروف تقليديا انه يتم زراعة نباتات الجربيرا عن طريق البذور في برامج التربية وهنا يتم انتاج نباتات مختلفة نظرا لما يحدث من انعزالات تؤدي الى انتاج ازهار متباينة الالوان وهنا يمكن لمربي النبات ان يختار لون الزهرة المطلوبة او المميزة ويتم اكثار النبات عن طريق القمم النامية او البراعم الجانبية باستخدام زراعة الانسجة للمحافظة على لون وصفات الزهرة اي تكاثر خضري. كما انه من المعروف عند اجراء التهجينات بين اصناف هذه النباتات فان معدل نجاح انتاج البذور ضئيل وقد تنتج بذرة واحدة في قرص الزهرة مما يؤدي الى انتاج نبات واحد هجين وهنا ايضا يمكن اكثاره بالزراعة النسيجية. وخلال هذه الطرق يمكن انتاج عدة ملايين من النبات الجديد خلال عام واحد.

وعلى العموم فان اختيار نباتات فردية ثم انتاج نويات من هذه النباتات الفردية فهي طريقة تسرع من برامج التربية وتعطي المربى وسائل غير تقليدية في التحسين السريع للأصناف النباتية (Murashige et al., 1974, Day 1980, Kucherenko, 1985)

ان فكرة ان الخلايا المنزرعة معمليا in vitro يمكن استخدامها كوحدات للانتقاء او الاختيار منها على اساس المقاومة للأمراض او ذات صفات مختلفة تعتبر اكثر نجاحا من اختيار النبات الكامل، هذه الفكرة تعتمد على حدوث طفرات محدثة او ذاتية Spontaneous في المعمل ثم بعد ذلك يتم اختيار الخلايا المقاومة والتي تكون تحت تأثير العامل المطفر، بعد ذلك يتم الحصول على النباتات من تلك الخلايا وحدوث تكشف ونمو للخلايا المقاومة الى نباتات كاملة (1985,Kucherenko).

الا ان هذه النباتات الناتجة ليس من الضرورة ان تحافظ على قدرتها على التحمل او المقاومة عند نقل النباتات الى الحقل ومن المحتمل حدوث ارتداد الى الاصل عندما تكون هذه التغيرات غير ثابتة وراثيا وبالتالي لا يتم انتقالها خلال الاجيال المتعاقبة.

زراعة وانقاذ الاجنة

ان تقنية زراعة وانقاذ الجنين هي واحدة من بين الاساليب المعملية او مزارع الانسجة المستخدمة مع بعض الانواع النباتية. وهي تشير الى عدد من التقنيات التي تدعم نمو جنين غير ناضج او ضعيف ليكون نباتا قادر علي النمو. تستخدم هذه الاساليب عادة لإنتاج نباتات من الهجن التي تعطي بذورا غير حية.

ولكي يتم انقاذ الجنين لابد من بدء الزراعة قبل موته. يعتمد على نوع البيئة وعلى مرحلة نمو الجنين. تحتاج الاجنة الصغيرة الى بيئة معقدة ذات تركيزات عالية من السكروز، بينما يمكن للأجنة الاكثر نضجا ان تنمو عادة في بيئة بسيطة ذات سكروز بمستوي اقل.

في المعهد الدولي لبحوث المحاصيل للمداريات شبه الجافة (ICRISAT)، استخدمت هذه التقنية لتحسين اصناف من الفول والحمص حيث تم تطوير نوعية هجين من الفول (ICPH8) تنضج في ۱۰۰ يوم بدلا من ۲۰۰ يوم. هذه النوعية مقاومة ايضا لمسببات الامراض والحشرات.

من المشاكل التي تواجه برامج تربية اشجار الفاكهة هي العقم الكامل او الجزئي لأعضاء التناسل في الازهار وعدم التوافق الذاتي او الخلطي وعدم التوافق ما بعد تكوين الزيجوت. الا ان اجهاض جنين الهجين لا يعنى انها غير حية. يمكن احياء الهجن بعزل الجنين وزراعته في بيئة ملائمة

Emershad and Ramming, 1994; Misic et al., 1980 and Ramming, 1986

في تقنيات انقاذ الجنين معمليا. لقد تم الحصول على عديد من هجين النباتات ذات النواة الحجرية النوع خلال برنامج كما في  P. salicina, P. spinosaو P.domestica L. وايضا كما في برنامج هجين Prunus avium

هناك صعوبة في انتاج بعض الهجن بالطريقة التقليدية فمثلا اذا تم تلقيح نوعين مختلفين من الشعير وهما H. vulgare X H.bulbosum يعطي هجينا عقيما نظرا لفشل الاندوسبيرم في النمو اثناء تلقيح البويضة وبالتالي يفشل الجنين في التكون لإنتاج بذرة خصبة يمكن انباتها. الا انه عند عزل الجنين غير الناضج وزراعته على بيئة صناعية ملائمة وكبديل للاندوسبيرم فغالبا ما يؤدي ذلك الى انتاج نبات هجين. ومن هذا نرى انه يمكن بهذه الوسيلة ادخال عديد من الصفات لإنتاج كثير من النباتات والطرز الجديدة. وقد استخدمت هذه الطريقة ايضا في ادخال صفة المقاومة من الاصناف البرية من الطماطم  Lycopersicom peruvianum الى الطماطم التي تستخدم في الاكل وذلك بغرض مقاومتها لاحد الفطريات Fulvia fulva حيث تم التهجين مع انقاذ الجنين 1980.Misic et al

يعتبر شجر النبق أو السدر كما ذكر في الكتب السماوية أحد محاصيل الفاكهة النادرة والمتحملة للجفاف كما أن للثمار فوائد طبية وتنتشر في مصر والوطن العربي كأشجار متناثرة في الحقول وفي مصر تتركز في محافظات الوجه القبلي. وفي الخمسينيات من القرن الماضي ظهرت طفرة برعميه في النبق في محافظة أسيوط أطلق عليها "نبق حزين" والتي لاقت أهمية كبيرة نظراً لكبر حجم الثمار وزيادة اللب وصغر حجم البذور. وتواجه أشجار "نبق حزين" مشكلة عدم إنبات البذور ويتم الإكثار عن طريق التطعيم فقط وهي طريقة تقليدية بطيئة للإكثار.

أجريت دراسات على جنين بذور هذا الصنف في جامعة أسيوط باستخلاص الأجنة غير الناضجة من بذور الثمار وبعد الأسبوع الثامن عشر من العقد حيث نجحت في الإنبات على بيئة MS والتي تحتوي على 5 ملليجرام BA.

أكدت الدراسات التشريحية للبذور أنها رفيعة وضيقة جدا والقصرة سميكة وصلبة أما الجنين فصغير كما أن الفلقتين كبيرتان في الحجم وتحتل معظم مساحة البذرة ويجعلها تشكل ضغطا كبيرا على الجنين مما يؤدي إلى إجهاضه. وتعتبر هذه الدراسات من الأهمية بمكان لإنقاذ جنين صنف النبق حزين باستخدام إحدى تقنيات زراعة الأنسجة والمفيدة في العديد من برامج التربية للأصناف (El-Agamy et al., 2004 and Abo-Elella, 2008)

الاندماج الخلوي (دمج البروتوبلاست) protoplast fusion

يعتبر التلقيح بين الأصناف من أهم التقنيات التقليدية التي اتبعت خلال القرن العشرين حيث أمكن الحصول على أصناف هجن متميزة في عديد من المحاصيل ولعلنا نذكر الثورة الخضراء التي قادها العالم نورمان برلوج خلال السبعينيات من القرن الماضي والتي اعتمدت على قوانين مندل للوراثة وكان تطبيقها في نباتات الحبوب مثل القمح والذرة والتي استغل فيها الأصناف البرية للحصول على بعض الصفات ونقلها للأصناف الزراعية لها أثر كبير في النهوض بإنتاجيتها.

وفيها يتم نقل عوامل الوراثة من نبات إلى آخر باستخدام التلقيح والإخصاب وإنتاج ما يسمى بالزيجوت الذى يحمل الصفات الوراثية نصفها من الأم والأخرى من الأب لينتج فرداً جديداً بصفات مشتركة وبالتالي أصناف جديدة إلا أنه هناك بعض النباتات التي يصعب تهجينها بالطريقة التقليدية لأسباب عديدة منها عدم وجود قرابة بين هذه النباتات أو عدم التوافق أو وجود عقم ذكري أو غير ذلك.

إن البروتوبلاست protoplast عبارة عن خلية نباتية إما أن تكون خلية جسمية (2N) أو خلية جنسية (1N) بعد هضم الجدار الخلوي السليولوزي الأصل باستخدام إنزيمات هضم السليولوز وينتج عن ذلك خلية يحدها من الخارج غشاء رقيق وتتحول إلى خلايا كروية الشكلي منفردة (انظر الشكل التالي) (2005 ,Davey et al).

شكل خلايا البروتوبلاست تحت المجهر الضوئي

ويقصد بدمج البروتوبلاست هو دمج خليتين من نباتات مختلفة مهضوم جدارهما بواسطة الإنزيمات للحصول على بروتوبلاست جديد يمثل المحتوى الوراثي للخليتين (الشكل التاليين). علماً بأن البروتوبلاست الأخير قد يكون غير ثابت وراثياً وأيضاً ليس بالضرورة تكشفه إلى كالوس ثم إلى نبات كامل. إلا أن هذه الطريقة قد فتحت الباب للحصول على أصناف جديدة وساعدت في الإسراع في برامج التربية لعديد من النباتات ويمكن إدراج هذه الطريقة ضمن طرق الوراثة الجزيئية molecular genetics والتي تتجنب استخدام التكاثر الجنسي التقليدي في نقل المادة الوراثية والحصول على تراكيب وراثية غير تقليدية.

نظرياً يمكن فصل البروتوبلاست لنباتات عديدة ومن أنسجة مختلفة ولكن يفضل الفصل من الأوراق الخضراء حديثة العمر لسهولة هضم جدر الخلايا التي تحتوي على طبقة رقيقة من الكيوتيكل بواسطة إنزيمات الهضم المتخصصة. كما يمكن الحصول أولاً على البروتوبلاست من الكالوس ثم إنشاء مزارع الخلايا في البيئة السائلة وهي تتميز بجدر رقيقة وفي مرحلة انقسام نشط في المزارع الحديثة.

يتطلب استخدام خليط من الإنزيمات أهمها السليوليز cellulase لتفكيك وتحليل الجدار الأولى للخلية وكذلك البكتينيز pectinase لفصل الخلايا بعضها عن بعض ويمتاز استخدام الإنزيمات من المصادر الطبيعية عن استخدام الإنزيمات الصناعية (Kao and Michayluk, 1974)

عزل البروتوبلاست وزراعته

1- اختيار الجزء النباتي (أوراق غضة - أو مزرعة خلايا معلقة ويفضل نباتات جيدة النمو - خالية من الأمراض - نامية في المعمل أو الصوبة.

2- تعقيم سطحي جيد للأوراق وإزالة طبقة البشرة من الأوراق.

3- فصل البروتوبلاست من خلايا الميزوفيل آو من معلق الخلايا باستخدام إنزيمات هضم الجدار الخلوي مع ضب الاسموزية (700-800 ملليموز).

4- تنقية البروتوبلاست خلال مناخل دقيقة (60-80 ميكروميتر) للتخلص من بقايا الخلايا.

5- تعليق خلايا البروتوبلاست في محلول البيئة المغذية.

6- تحضين خلايا البروتوبلاست.

۷- اعاده تكوين الجدار حول البروتوبلاست.

۸- حدوث الانقسام الخلوي الأول.

9- استمرار الانقسام لإنتاج نوية من الخلايا المتماثلة colony

شكل يبين طريقة عزل البروتوبلاست من خلايا بشره الورقة باستخدام إنزيمات هضم الجدار السليولوزي للخلية النباتية ثم زراعة خلايا البروتوبلاست لاستعادة تكوين الجدار يلى ذلك تضاعف الخلايا لتكوين الكالوس

دمج البروتوبلاست

1- خلايا البروتوبلاست من مصادر نباتية مختلفة وضع البروتوبلاست المختلف سويا ويضاف مادة PEG مع تركيز عال من أيونات الكالسيوم وزيادة رقم الحموضة عند 10.5 pH.

2- يحدث اقتراب وتجمع لخلايا البروتوپلاست.

3 - تخفيض تركيز مادة PEG.

4- حدوث الاندماج الخلوي للبروتوبلاست.

5- نقل الخلايا إلى بيئة زراعة ملائمة.

6- حدوث انقسام ميتوزي للبروتوبلاست المندمج.

7- تكون خلايا تحمل صفات مشتركة.

شكل يوضح طريقة دمج البروتوبلاست من مصدرين مختلفين للحصول على تراكيب وراثية جديدة

يوفر البروتوبلاست مدخلاً جيداً لدراسة العلاقة بين العائل والفيروس الذي يصيبه وقد طبقت هذه الطرق في دراسة عديد من الفيروسات النباتية باستخدام بروتوبلاست من ميزوفيل الورقة وقد أدى تطور إنماء وحفظ البروتوبلاست إلى تطور وفهم مواز لهذه الدراسات Aoki and Takebe, 1969; Asselles and Cocker, 1980 and. Davey et al., 2005

إن مجرد إزالة جدار الخلية للحصول على البروتوبلاست فتحت المجال لمزيد من تطبيقات التداول المعملي للخلايا النباتية ويجب أن نذكر أن برامج التربية التقليدية التي تعتمد على تعريض النباتات للظروف غير الملائمة مثل الملوحة العالية أو التعرض لسمية العناصر الثقيلة بالتربة ثم الانتقاء لما هو متحمل لهذه الظروف، ومن المعروف أن هذا العمل يحتاج إلى فترة زمنية طويلة فضلا عن عمل مضن وتكاليف عالية للوصول إلى النتائج المرجوة ولكن باستخدام الخلايا المفردة أو البروتوبلاست يسمح بانتقاء ملايين الخلايا في حيز صغير ووقت قصير نسبياً ويمكن لهذه الخلايا أن تتكشف إلى نباتات كاملة وتختبر للمقاومة بعد ذلك على مستوى النبات حتى يتم التأكد من ثبات الصفة المكتسبة.

أشار 1983. Dodds إلى تطبيقات البروتوبلاست في مجال إنتاج أشجار الفاكهة حيث يتم عزل البروتوبلاست ثم عمل دمج بين بروتوبلاست أصناف فاكهة مختلفة للحصول على هجن جديد بين سلالات غير متوافقة جنسيا ولا يمكن تلقيحها وهذا يخدم بشدة برامج تربيه الفاكهة وتحسينها علي المدي الطويل.

التربية باستخدام المطفرات

في نهاية العشرينيات من القرن الماضي اكتشف الباحثون أنه يمكن زيادة معدل التطفر أو حدوث الطفرات mutations وذلك بتعريض النباتات إلى أشعة إكس (X rays ) وكذلك بعض الكيماويات وهنا تسارعت طرق تربية النبات باستخدام تلك التقنية وأمكن إنتاج عديد من الأصناف النباتية الجديدة (الجدول ادناه).

جدول يبين إنتاج بعض الأصناف النباتية خلال برنامج التربية اعتمادا على استخدام المطفرات

ومن المعروف أنه قد تحدث الطفرات ذاتياً دون تدخل الإنسان وينشأ عنها صفات جديدة ولكن هذه الطفرات نادرة الحدوث بالرغم من أن لها دوراً في نشأة وإنتاج بعض الأصناف والطرز النباتية إلا أنه لا يمكن الاعتماد عليها بصفة مطلقة في برامج التربية لاعتمادها على الصدفة ومدى إمكانية ملاحظتها، كذلك مدى ثباتها وانتقالها خلال الأجيال المتعاقبة.

ومن جهة أخرى يمكن إحداث الطفرات الصناعية وذلك بتعريض البذور أو النباتات أو الأنسجة والخلايا إلى مطفرات إما إشعاعية منها أشعة إكس (Xiray) وأشعة الراديوم أو جاما أو الأشعة فوق البنفسجية (1992 ,Novak and Brunner ) أو استخدام مواد كيماوية مثل مركب ethylmethane Sulphonate ويطلق عليه EMS.

مع التطور الحادث في مجال التكنولوجيا الحيوية وخاصة زراعة الأنسجة واستخدامها مع إحداث الطفرات والانتخاب المعملي للحصول على طفرات جديدة ومميزة، حدث تقدم في تربية النبات وبرامج إنتاج الأصناف وقد واكب ذلك تعاون مربي النبات مع المشتغلين بمجال التكنولوجيا الحيوية للحصول على طفرات مفيدة ومرغوبة للمستهلك في اسرع وقت ممكن.

ينقسم الاختلاف الحادث في زراعة الأنسجة أو في الطبيعة إلى اختلافات إما epigenetic او اختلافات وراثية genetic والقسم الأول لا يكون مفيدا في تحسين المحاصيل بصفة عامة حيث إن التغيرات التي قد تحدث وتشمل تقزم أو شكل الورقة غير ثابتة ولا يحدث لها انتقال خلال التكاثر الجنسي إلى النسل. ولكن من ناحيه أخرى إذا حدث في الطبيعة epigenetic قد يمكن الاستفادة من هذه التغيرات بعزل هذه الأنسجة وزراعتها في بيئة ملائمة للحفاظ على الصفات المرغوبة والجديدة وبالتالي الإكثار اللاجنسي (الخضري) خلال تقنيات زراعة الأنسجة.

أما التغيرات الوراثية يمكن أن تورث إلى النسل سواء كانت هذه الاختلافات صغيرة أو كبيرة أو محدثة أو ذاتية الحدوث. هذه الاختلافات قد تكون كامنة في خلايا نبات الأم وقد يساعد على إظهارها أنه خلال زراعة الأنسجة في المعمل يتم أخذ أجزاء صغيرة من النسيج كبداية للإكثار حيث لا تتماثل جميع الأجزاء في النبات في النظام أو المسلك الفسيولوجي، وعموماً وجد أن الخلايا الناضجة تتجه إلى التغير في المحتوى من العدد الكروموسومي (ploidy) وهناك كثير من التفسيرات لحدوث ظاهرة الاختلاف الوراثي.

العوامل التي تؤدي إلى الاختلاف في مزارع الأنسجة

1- فترة بقاء النسيج في المعمل، فكلما زادت هذه الفترة زادت إمكانية حدوث اختلافات.

2- تؤدي بعض منظمات النمو المضافة إلى البيئة الغذائية إلى حدوث اختلافات ومن اهمها 2.4-D kinetin.

3- الضغوط الناتجة عن إضافات البيئة الأخرى مثل المركبات المخلبية وإضافة KNO₃ بتركيز عال وبعض العناصر المعدنية الدقيقة، يكون لها دور في عدم الثبات الوراثي، وقد ذكر أيضاً أن لبن جوز الهند ومستخلص الخميرة قد يؤدي إلى حدوث اختلافات وراثية.

4- كلما زاد نمو النسيج المستخدم كبداية في الزراعة قد يحدث اختلافات وراثية.

5- نمو الكالوس لمدة طويلة في المعمل قد يؤدي أيضاً إلى حدوث الاختلافات الوراثية.

هذه الاختلافات الوراثية قد تحدث أثناء إنماء الأنسجة والخلايا وتعرضها للعوامل السابق ذكرها إحداها أو بعضها، وتنتج نباتات مخالفة للأم وهي تشمل اختلافات مورفولوجية أو في مقاومة الأمراض أو في صفات المحصول وقد اصطلح على هذا انه  Somaclonal variation وهذه الاختلافات قد تكون صفات كمية أو وصفية من الناحية الوراثية. هذه الاختلافات أيضاً قد تكون راجعة إلى عدم الثبات الوراثي في أنواع معينة من نوع النباتات فقد وجد 2003 ,Ibrahim اختلافات مظهرية عديده في نباتات الموز الناتج عن الإكثار الدقيق وأن صنف الموز وليمز أكثر ثباتاً من ناحية التباين الوراثي عن صنف جراند نان.

بينما في دراسة لإكثار بنجر السكر معملياً بواسطة زراعة الأنسجة أظهرت النتائج مطابقة النباتات الأصلية وناتج زراعة الأنسجة عند استخدام تحليل RAPD سواء كان هذا الإكثار بطريقة مباشرة أو غير مباشرة (من خلال الكالوس) وقد تطابقت هذه النتائج مع تحليل البروتين أيضاً (2008 .Bekheet et al).

وبالرغم من استخدام هذه الطريقة ومساعدة التكنولوجيا الحيوية في الإسراع للحصول على طرق إحداث الطفرات إلا أنه يجب أن نوضح أن الطفرات الصناعية غالباً ما يكون معظمها ضار واحتمال حدوث طفرة ذات صفات مرغوبة قليلة، وأن معدل حدوث الطفرات منخفض لذلك يجب استخدام عدد كبير من النباتات أو الخلايا كما أن فحص الأعداد الكبيرة من الخلايا أو النباتات يحتاج إلى وقت طويل للتأكد من ثبات مثل هذه الصفات المرغوبة.

استخدام تقنية زراعة الأنسجة في إنماء وإكثار بعض الكائنات إجبارية التطفل

تحتاج بعض الكائنات المتطفلة على النبات مثل بعض الفطريات والفيروسات وأيضا النيماتودا إلى وجود العائل النباتي وليس هنالك سبيل لإكثارها معملياً على البيئات الصناعية كغيرها من الكائنات الأخرى. وهنا تظهر أهمية تقنيات زراعة الأنسجة في إكثار مثل هذه الكائنات بغرض إجراء الدراسات المختلفة فيما يتعلق بعلاقة الكائن المرضي بالعائل مما يسهل سبل مكافحة هذه المتطفلات وأيضا يسهل اختبارات التقييم خلال برامج التربية للنباتات المقاومة للأمراض والآفات المختلفة

 (Kikkert et al., 1967, and Butcher 1980.)

1- إكثار النيماتودا في زراعة الأنسجة

إن معظم النياتودا النباتية تتغذي وتتكاثر في الجموع الجذري للعائل ويمكن اكثارها في الصوبات والمعامل باستخدام عائل نباتي ملائم ينمو في التربة. وهذه الطريقة قد تتطلب ضرورة توفير صوبات ملائمة وتجهيز تربة نظيفة خالية من المسببات المرضية الأخرى، هذا بالإضافة إلى صعوبة عزل هذه النيماتودا بطريقة مثالية.

إن الاتجاه نحو إكثار النيماتودا باستخدام الأنسجة النباتية المعزولة من النبات مثل الجذر والكالوس حققت أولى نجاحاتها عام1954(Mountain, 1954)  عندما استخدم هذا العالم جذور الذرة والدخان في اكثار النيماتودا Pratylenchus minyus وبهذه الطريقة يمكن دراسة دورة حياة النيماتودا بدقة في وسط معقم خال من المكونات الميكروبية الأخرى وقد استمر نموها لمدة أربعة أسابيع مع ملاحظة تجديد البيئة Subculture كل أسبوعين وقد أمكن أيضاً الحصول على أعلى عدد من النيماتودا خلال ثلاثة أشهر عند درجة ٢٥ م، لكن من ناحية أخرى فقد لوحظ أن بعض أنواع النيماتودا الأخرى يمكن أن تؤدي إلى تدهور في مزارع الكالوس حيث توقف انقسام الخلايا النباتية ويمكن أن يتحول النسيج إلى اللون الأصفر ثم الأسود ويموت كما هو الحال في نيماتودا Pratylenchus penetrans.

وتتميز طريقة استخدام الخلايا والأنسجة في إكثار النيماتودا بسهولتها مع إمكانية إكثارها في فترة قصيرة كما أنها تعتبر طريقة تطبيقية لإنتاج نيماتودا تعقد الجذور Meloidogyne spp وهي جيدة بصفة عامة في أجناس آخري من النيماتودا.

تتميز مزارع الجذور بخواص عديدة تجعلها جذابة لاستخدامها في بحوث العلاقة بين العائل والطفيل:

1- تتميز بمعدل عال للنمو وفي نفس الوقت إنتاج نموات ثانوية كمصدر لا ينضب لمادة تجريبية متماثلة ونعني الجذور الثانوية التي تتكون من الجذور الأصلية المنزرعة.

2- الجذور المعزولة تنمو تحت ظروف معقمة وظروف بيئية متحكم فيها وفي غياب الملوثات الميكروبية.

3- تنمو هذه الجذور في بيئة تتكون من مركبات بسيطة وهي غير معقدة التركيب

كذلك تبقى على الشكل المورفولوجي لها كما لو كانت متصلة بالنبات وهذا ما يجعلها مناسبة تماماً لدراسة ميكانيكية العدوى بالكائنات الممرضة للجذور (Butcher, 1980 and Jones, 1980)

ومع ذلك فإن هذه الطريقة لم تستخدم على نطاق واسع حتى الآن. وقد يرجع ذلك إلى صعوبة عزل أنواع من الجذور النباتية بصورة حية أو أن هذه الكائنات من النوع facultative pathogen وتؤدي إلى تدمير مزرعة الجذور (Jones ,1980)

2- اكثار الفيروس

وضع العالم Kikkert وآخرون عام ۱۹۹۷ نظاماً وبروتوكولا لدراسة فيروس الطماطم  tomato spotted wilt virusفي البروتوبلاست لنبات الطماطم باستخدام مادة polyethylene glycol مع عدوى الفيروس بسلالة قوية. وجد أن 50 ٪ من خلايا بروتوبلاست الدخان كانت مصابة كما امكن تحديد وجود الحمض النووي الفيروسي كذلك بروتين الفيروس المصنع بعد العدوى ب16 ساعة وبعد 90 ساعة امكن استخدام اختبارImmuno-cytology  حيث تراكم كميات كافية من جزيئات الفيروس. وقد أكدت الدراسات الأخرى مثل استخدام الميكروسكوب الإلكتروني وعدوى العوائل المتخصصة إنتاج هذا الفيروس في الخلايا وأن دورة تضاعف الفيروس قد اكتملت. وقد وجد أن محاولات عدوى بروتوبلاست اللوبيا بنفس الفيروس أعطت نتائج أقل بالمقارنة بخلايا الدخان Kikkert, et al.1997.

امكن إصابة البروتوبلاست المعزول من ميزوفيل أوراق الدخان بواسطة فيروس TMV وهو تبرقش الدخان وقد حدث تضاعف لجزيئات الفيروس عند إعادة زراعة البروتوبلاست في بيئة سائلة جديدة ووصل التركيز الأعلى لجزيئات الفيروس بعد ٢٢ ساعة وقد استخدم اختبار صبغة الفلورسنت فوجد أن 3-7٪ من البروتوبلاست كانت مصابة بالفيروس (Aoki and Takebe, 1969).

امكن الحصول على نباتات كاملة من بروتوبلاست أوراق الدخان المصابة بفيروس PVX وأيضا درس تأثير مادة الفيروزول المضادة لتضاعف هذا الفيروس (Shepard, 1977).

أشار واتس (1980 .Watts et al) إلى إمكانية عدوى وتضاعف أكثر من فيروس واحد داخل البروتوبلاست مما يشير إلى إمكانية دراسة تأثير هذه الفيروسات المختلفة داخل نفس الخلية.

3- اكثار الفطريات .

أشار العالم Ingram إلى إمكانية نمو الكائنات الدقيقة إجبارية التطفل في مزارع الكالوس للعائل النباتي الخاص بالطفيل وقد أكد على أهمية ذلك للحفاظ على سلالات نقية ومعرفة للطفيل هذا بالإضافة إلى ضمان نقل الطفيليات خلال مراكز البحوث في الدول المختلفة بأمان تام بدلاً من نقل العوائل المصابة نفسها

(1980 ,Ingram . 1980, Jones).

جدول يوضح الفطريات التي أمكن إنماؤها بنجاح في العوائل النباتية (1980,Ingram)

وتفيد هذه الطرق في دراسة العلاقة بين الكائن والطفيل على المستوى المعملي المتحكم به مما يؤدي إلى زيادة فهم عديد من طرق وأساليب التطفل وبالتالي الوصول إلى أفضل السبل للمكافحة، انظر الجدول السابق.

وتتلخص الطريقة في خطوات أساسية:

1- إنشاء مزرعة كالوس صحية وقوية من نسيج العائل على بيئة ملائمة في فلاسكات أو أطباق بتري وتحضن على درجة حرارة ملائمة في الظلام.

2- لكي يتم نمو الفطر علي بادرات من العائل النباتي لصنف حساس يجب تعقيم البادرة النامية وقد يتأتى ذلك بتعقيم البذور النامية وإنباتها في جو معقم ثم عدوى البادرات بجراثيم الفطر من السلالة المطلوبة وبعد إتمام العدوى غالبا بعد 72 ساعة من الحقن يتم أخذ قطع من أوراق البادرة المصابة ووضعها على كالوس النبات الذى أعد في بيئة زراعة الأنسجة الملائمة.

ومما هو جدير بالذكر أنه ليس جميع الفطريات الإجبارية التطفل يمكن نموها في مزارع الكالوس وقد ذكر كثير من المحاولات الفاشلة وقد يرجع إلى إفراز الفطر لسموم Aflatoxin في البيئة أو لسرعة نمو الفطر بمعدل أكبر من النسيج النباتي أو أن ظروف التحضين لا تلائم نمو الفطر والنسيج النباتي في نفس الوقت أو غير ذلك من الأسباب غير المعروفة (Buczacki, 1980, and Jones, 1980)

البذور الصناعية والأجنة الجسدية

البذور الصناعية هي بذور ناتجة من تغليف الأجنة الجسدية Somatic embryo بواسطة غلاف واق باستخدام مادة hydro-gel وتحضر في صورة كبسولات تحت ظروف التعقيم في معامل زراعة الأنسجة حيث يمكن زراعتها مباشرة في التربة سواء في الصوب الزراعية أو الحقل (Redenbaugh, et al, 1991, Nasr et al, 2006).

وهذا النظام قليل التكاليف وذو إنتاج عال وتستخدم بدلا من البذور الحقيقية وحيث أنها أجنة جسدية فإنها متطابقة وراثياً وهناك نوعان من البذور الصناعية إما بذور رطبة أو بذور جافة.

والأجنة الجسدية ثنائية القطب محتوية على مناطق القمة والقاعدة المرستيمية قادرة على تكوين المجموع الخضري والجذري، وتتشابه الأجنة الجسدية تركيبياً مع الأجنة الزيجوتية ولكنها آتية من خلايا جسدية وتستخدم لإنتاج نسخ مكررة ذات تركيب وراثي واحد ويتم إنتاج الأجنة الجسدية بكفاءة عالية الجودة خلال بروتوكول زراعة الأنسجة ثم تغلف بلجنينات الصوديوم هيدروجيل مع العناصر الغذائية الأساسية والهرمونات لإمداد الأجنة بالغذاء اللازم أثناء النمو عوضاً عن الإندوسبيرم كما في البذور الحقيقية. ويحدث تبادل لعنصر الكالسيوم محل الصوديوم الموجود بلجنينات الصوديوم عند إضافة محلول كلوريد الكالسيوم.

خلال عملية تكشف الأنسجة في المعمل ولحث تكوين الأجنة الجسدية فإن ذلك يتطلب العمل على دفع الخلايا الجسمية على الانقسام وتكوين قطبية جديدة وقد وجد أن بعض الاوكسينات لها دور هام وخاصة 2و4 داي كلوروفينوكسي حامض الخليك وكذلك 2و4و5 ثلاثي كلورو فينوكسي حامض الخليك ووجد أن مركبات البوتاسيوم والبرولين لها دور كذلك في تكوين تلك الأجنة. ويمر الجنين الجسدي بأربع مراحل للتكوين وهي الطور الكروي والقلبي والتوربيدو والفلقي،( الشكل ادناه)، وبعد ذلك يغلف الجنين مع إضافة الإندوسبيرم الصناعي لتكوين البذور الصناعية (Redenbaugh 1993, Redenbaugh, et al., 1991)

ومما هو جدير بالذكر أن الأجنة الجسدية نوعان مباشر وغير مباشر ويفضل لعمل البذور الاصطناعية استخدام الأجنة المباشرة أي التي نتجت بدون المرور بمرحلة الكالوس.

شكل يبين مراحل تكوين الجنين الجسمي خلال الاكثار المعملي من اليسار لليمين بالترتيب 1– الطور الكروي ٢- الطور القلبي ٢- الطور التوربيدي 4– الطور الفلقي

ومن العوامل المؤثرة على تكوين الأجنة الجسدية التي تعتبر أساس تكوين البذور الصناعية:

1- التركيب الوراثي للجزء النباتي.

2- مصدر الجزء النباتي المزروع.

3- نوع البيئة الغذائية المستخدمة للنمو.

4- منظمات النمو المضافة للبيئة الغذائية.

5- درجة الحرارة وشدة الإضاءة والتهوية.

خطوات إنتاج البذور الصناعية:

1- الحث علي تكوين الاجنة الجسدية خلال الإكثار المعملي.

2- نضج الأجنة الجسدية مرورا بالمراحل المختلفة، (انظر الشكل السابق).

3- تغليف الأجنة الجسدية.

4- زراعة البذور الصناعية في المعمل لتقييمها ثم في الصوبة والحقل.

5- اعتماد البروتوكول الملائم للنبات تحت التقييم للاستخدام التجاري.

مميزات البذور الصناعية:

1- نظام جيد لتداول الأجنة الجسدية في حالة جيدة مشابه للبذور الحقيقية.

2- توفير الوقت ومساحة الأرض الزراعية.

3- نظام جيد للحفظ في بنوك الجينات وتبادل المادة الوراثية بين الدول والجهات العلمية.

ولقد امكن إنتاج البذور الصناعية لنباتات نخيل البلح وذلك بتغليف الأجنة الجسدية كاملة النضج تحت الظروف المصرية كما سبق إنتاج البذور الصناعية للبرسيم الحجازي والبطاطا وهذه البذور تعتبر طريقة جيدة من طرق حفظ المادة الوراثية كما يمكن تبادلها من خلال بنوك الجينات العالمية Redenbaugh et al. 1986, Hamed et al, 2003, Ibrahim et al., 2003

وعلى نطاق ضيق يمكن تغليف القمة النامية وتكوين البذور الصناعية ويلاحظ هنا أن القمة النامية أحادية القطب وبالتالي لا يمكن زراعتها مباشرة في التربة ولكن يمكن حفظها والتبادل بين بنوك الجينات فلقد أمكن إنتاج بذور صناعية للأناناس من القمة النامية وكذلك تغليف القمة النامية للموز

 Tang et al., 1994, Ying and Gang, 2006, Nasr et al, 2006

مميزات إنتاج البذور الصناعية:

يمكن استخدام تكنولوجيا البذور الصناعية في الحالات الأتية:

1- إكثار الهجن وتكوين الأجنة الجسدية ثم تغليفها.

2- إكثار النباتات المهندسة الوراثية.

3- إكثار النباتات المنقرضة.

4- حفظ الأصول الوراثية المتميزة.

5- تبادل الأصول الوراثية بين بنوك الجينات والبلدان بسهولة ويسر.

6- الدراسة العلمية للنباتات الطبية والفاكهة ومحاصيل الخضر والحقل.

7- حفظ النباتات الخالية من الأمراض والمطابقة للأصل.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.