بروتوكول لتحضير مصفوفة مجهرية لقليلات النيوكليوتيدات Oligonucleotides

يعتمد البروتوكول على بناء المصفوفة نيوكليوتيدة اثر نيوكليوتيدة على سطح الرقاقة ذاتها (شكل1) (A) تتمثل

الخطوة (1) بحماية الشريحة الزجاجية بواسطة مجاميع حماية protecting group والتي تعرف بالقناع mask والحاوي على ثقوب في مكانات محددة تسمح بنفاذ الـ DNA ومناطق اخرى مغلقة تمنع الدنا DNA من النفاذ وتبقى المساحة تحتها محمية .

الخطوة (2) تضاف النيوكليوتيدة الاولى والتي ترتبط بوجود الضوء الذي يغمر المناطق غير المحمية ثم يضاف القناع الثاني وتضاف النيوكليوتيدة الثانية (3) بعد ذلك يضاف القناع الثالث وهكذا تستمر العملية الخطوة (4) و (5) و (6) و (7) وهكذا تستمر سلسلة قليلات الثالث النيوكليوتيدات بالاستطالة والاضافة تتك حسب الرغبة وهكذا يتم بناء مصفوفة مجهرية من القليلات النيوكوتيدية (الشكل 1) B ويمكن استخدام هذه المصفوفة المجهرية في دراسة الوظائف الجينومية وهذه القليلات اليكليوتيدية يمكنها التعرف على تعاقبات الجينات ومن خلال المجس المعلم بصبغة تفلورية والمعزمول من طور تطوري معين يرتبط هذا المجس مع المصفوفة (الشكل 1) C ، استخدم هذا الاسلوب او البروتوكول في انتاج مصفوفة معقدة لجينوم خميرة الخبز (الذي يضم 6200 جين وتم تحديد تعاقباتها بدقة) ولكل من هذه الجينات تم  تحضى نيوكليوتيدي يتكون من 25 قاعدة تم بناءها على اساس المعرفة المسبقة بتعاقبات جينوم الخميرة وتم وصف القليلات النيوكليوتيدية في مصفوفات وعلى اربعة رقائق وبنفس الترتيب الموجود في الكروموسوم . واستخدمت هذه المصفوفات لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني في خلايا تنمو في ظروف فسلجية . اما المجسات " probe " فقد يم تحضيرها من الرنا المرسال mRNA الكلي من الخلايا النامية في الظروف الفسيولوجية المختلفة . هذا ولا بد من ملاحظة ان هذا الاسلوب لمصفوفات الدنا DNA يكون منهجا او مقاربة قد تكون بديلا للتحليلات الطفورية mutational analysis وفي كلا الاسلوبين فإن الهدف الاساسي هو للتعرف على مجموعة الجينات او البروتينات والتي تكون ذات صلة مهمة لأي من المسارات او السيرورات الفسيولوجية للتحليلات الطفورية التقليدية يمكنها انجاز هذه المهمة عن طريق تحديد الطافرات التي تؤدي الى اغلاق مسار حيوي ايضي مهم والذي يؤدي بالتالي الى فقدان الناتج البروتيني لهذ المسار اما بالنسبة الى تقنية الرقاقات chip technonlogy تؤدي نفس الهدف عن طريق تحديد الرنا المرسال mRNA والذ يستنسخ الى البروتين . يمكن استخدام رقاقات الدنا في تحديد الطافرات ، حيث يمكن تحضير قليلات النيوكليوتيدات لكي تكون مكملو ومتمماتها complementary لكافة التغايرات الطفورية البسيطة المحتملة في القطع والمناطق الوراثية قيد الدراسة . تعد الخطوة الاخيرة التي تعقبت عملية التهجين وهي خطوة المسح بالليزر (شكل 2) ، حيث تظهر البقع المهجنة بثلاثة الوان (الاحمر والاخضر والاصفر) وتعد هذه الخطوة وتفسيرها قمة الابداع في تقنية المصفوفات المجهرية . وتتطلب دقة كبيرة لم يمكن استخدام الحاسوب في تمييز النتائج) .

الشكل (7-3) : اسلوب تخليق مصفوفة كبيرة من قليلات النيوكليوتيدات على شريحة زجاجية بطريقة التخليق في موضعه (in Situ)

الشكل (2) : يبين الصورة التفلورية لمصفوفة مجهرية الناتجة من عملية للمسح بالليزر .

1. من الرنا المرسال الكلي Total mRNA نحصل على الدنا المكلمة eDNA الحاوية على نيوكليوتيدات متفلورة بواسطة تقنية الاستنساخ العكسي Reverse Transcription يليه اجراء تقنية التهجين Hybridization مع الشريحة او المصفوفة .

2. يتم مسح الشريحة او المصفوفة باشعة الليزر والحصول على صورة تفلورية .

3. يمكن مقارنة نموذجين مختلفين من الرنا المرسال mRNA في وقت واحد وباستخدام نيوكليوتيدات متفلورة بلون مختلف .

يمكن قراءة النتائج كالاتي :

اللون الاحمر (Red) = زيادة او استحثاث للـ mRNA

اللون الاخضر (Green) = تناقص او انخفاض للـ mRNA

اللون الاصفر (Yellow) = رنا مرسال mRNA غير متغير