مكونات بيئات النمو المستعملة في زراعة الأنسجة (تركيز أيونات الهيدروجين (الرقم الهيدروجيني pH))

يتضح من استعراض العناصر الغذائية المكونة للبيئة أن امتصاص الأيونات المختلفة يتوقف بدرجة أساسية على الرقم الهيدروجيني للبيئة. أو بمعنى آخر تركيز أيونات الهيدروجين في الوسط، ومن المعروف أن مقياس الرقم الهيدروجيني يبدأ من 1 إلى 14 ونقطة التعادل هي 7 وبانخفاضها تزيد الحموضة وبزيادتها عن 7 تزيد القلوية. والماء المقطر الخالي من الغازات مثل ثاني أكسيد الكربون يكون متعادلاً . ويتراوح الرقم الهيدروجيني لسيتوبلازم الخلايا بين 6.7 - 7.7 أما الفجوات العصارية فرقمها الهيدروجيني 4-6 وأثناء عمليات الأيض تتكون مركبات حمضية يجب معادلتها. وأهم طرق معادلة هذه المركبات هو مصاحبتها لأيون الهيدروجين أو البوتاسيوم حتى يتم ضخها خارج الخلايا ومعادلتها بالهيدروكسيل ومن الجدير بالذكر أن للرقم الهيدروجيني تأثير مشابه لبعض منظمات النمو حيث يؤدى تغيير الرقم الهيدروجيني الخلوي وكمية أيونات الكالسيوم في المُستأصل النباتي إلى تغيير الرقم الهيدروجيني للسيتوبلازم وذلك بطريقة تشابه تأثير الأوكسين والذي تفسر إحدى آليات عمله في تحرير أيون الهيدروجين من جدر الخلايا (2001 ,Felle).

وعلى العموم فإن النباتات في مزارع الأنسجة تكون غير حساسة بدرجة عالية لتغير الرقم الهيدروجيني في مدى يتراوح بين 4.5 و 7، وإذا انخفض الرقم الهيدروجيني عن هذه القيمة أو زاد عنها فإن نمو الأنسجة يقف غالباً. فالانخفاض الشديد في الرقم الهيدروجيني يعمل على تحول الفوسفات العضوي إلى غير عضوي ويقل تخليق المركبات الناقلة للطاقة وبالتالي ينخفض معدل النمو Mimura et al 2000. وعند الحديث عن الرقم الهيدروجيني للبيئة يؤخذ بعين الاعتبار ثلاث نقاط وهي تأثيره على مكونات البيئة، وتأثيره المباشر على الخلايا النباتية، وكذلك تأثيره على التفاعل بين الخلايا والبيئة. والرقم الهيدروجيني المناسب للبيئة لا بد أن يفي بالشروط التالية.

• لا يعيق الوظائف الحيوية للأغشية الخلوية والسيتوبلازم.

• ضمان عدم ترسيب الأملاح في الوسط المغذى.

• لا يؤثر على امتصاص مكونات البيئة والهرمونات.

• لا يؤثر على تصلب البيئة.

تأثير الرقم الهيدروجيني للبيئة على امتصاص مكوناتها

ربما ينحصر تأثير الرقم الهيدروجيني على مزارع الأنسجة على امتصاص وثبات مكونات البيئة المختلفة وليس على الخلية نفسها بطريقة مباشرةMimura et al., 2000  وبصورة عامة يزيد امتصاص الأيونات سالبة الشحنة في الوسط الحامضي بينما يزداد امتصاص الكاتيونات في الوسط القلوي. وبالطبع يؤدى امتصاص الأيونات إلى تغير الرقم الهيدروجيني للبيئة كما ذكر عند مناقشة امتصاص الأمونيا والنترات. وبذلك يؤثر الرقم الهيدروجيني للبيئة على تيسر وامتصاص بعض العناصر والأيونات غير العضوية، فامتصاص الفوسفات مثلا يكون سريعاً في الوسط الحامضي ويقل بزيادة الرقم الهيدروجيني، وعندما يصل الرقم الهيدروجيني للبيئة إلى 6.2 يتحد الحديد إن لم يكن موجوداً في صورة مخلبية مع الفوسفات ليكون فوسفات الحديدوز غير الذائبة. كذلك يتأثر امتصاص الأيونات العضوية بالرقم الهيدروجيني للبيئة فيزيد امتصاص معلق خلايا الدخان لحامض الليسين بانخفاض الرقم الهيدروجيني للبيئة، كما يتأثر امتصاص منظمات النمو مثل NAA و IAA و 2,4-D و ABA ويزيد تأثير الرقم الهيدروجيني على امتصاص مكونات البيئة بزيادة الفرق بين الرقم الهيدروجيني للبيئة وسيتوبلازم الخلايا.

اختيار وضبط الرقم الهيدروجيني للبيئة

على العكس من النباتات النامية في تربة طبيعية حيث تنمو الجذور جيدا في تربة ذات رقم هيدروجيني 6.0-7.3 فإن معظم الخلايا في مزارع الأنسجة تتحمل الرقم الهيدروجيني 4.5-7.2 وتموت عند الرقم الهيدروجيني الأقل من 2.5-3.0 أو أعلى من 8.0 ويوضح جدول رقم (1) تأثير تباين الرقم الهيدروجيني عند تحضير البيئة على نمو نبيتات البطاطس عقب زراعة العقد الساقية. وعلى العكس من ذلك وضح (2005) Bhatia & Ashwatha أن تكشف ونمو الأشطاء من الأوراق الفلقية للطماطم لم يتأثر بصور كبيرة باستعمال بيئة ذات رقم هيدروجيني يتراوح بين 4.5 و 7.5 ، وربما يشير ذلك إلى اختلاف استجابة النوع النباتي. وفي معظم الحالات يتم ضبط الرقم الهيدروجيني عند تجهيز البيئة على 5-6 ويفضل أن يكون لمزارع النباتات الخشبية 5.2 أما العشبيات فيفضل أن يكون 5.8. ومن الواضح أن هذه القيم أقل من المتبع في المزارع المائية حيث تتراوح بين 6.0 و 7.3. وهناك تباين بسيط في الرقم الهيدروجيني للبيئات المختلفة اعتماداً على نوع النبات والنسيج المنزرع. ويعتقد (1990) .Sarma et al أن طريقة إضافة الآجار إلى البيئة تلعب دورا في التغير الحادث في الرقم الهيدروجيني فعند اضافة الآجار إلى بيئات MS و B-5 و N6 ثم تعقيم البيئة فإن الرقم الهيدروجيني ينخفض. وكان الانخفاض أقل عند خلط الآجار في الماء المقطر ثم إضافته للبيئة قبل التعقيم وكان الانخفاض في كلا الحالتين تدريجيا مع الزمن، وأصبحت البيئة أكثر حموضة عندما زرع عليها كالوس نباتات Panax ginseng.

وعادة يتم استخدام هيدروكسيد الصوديوم أو البوتاسيوم لرفع الرقم الهيدروجيني إذا كانت حمضية حيث يتحد OH^- مع ⁺H البيئة ليكون ماء وبذلك يرتفع الرقم الهيدروجيني للبيئة. وإذا كان الرقم الهيدروجيني مرتفعاً فيضاف HCI الذي يتأين في الوسط ويتحد ⁺H مع OH^- البيئة ليكون ماء وينخفض الرقم الهيدروجيني. وحيث أن الوزن الجزيئي لهيدروكسيد الصوديوم هو 40 فيضاف 4 جم منها إلى 100 مل ماء ليعطى محلول تركيزه 1 مليمول. أما الوزن الجزئي لحامض الهيدروكلوريك 36.5 لكنه يباع في صورة محلول تركيزه 38 % ومن ثم فإن 9.6 مل منه تضاف إلى 100 مل ماء لتعطى 1 مليمول.

جدول 1: تأثير الرقم الهيدروجيني على نمو نباتات البطاطس المنزرعة بالعقد الساقية (2003 ,Sanavy & Moeini).

للخلايا النباتية القدرة على التحكم في ثبات الرقم الهيدروجيني للسيتوبلازم ويكون لتغيير الرقم الهيدروجيني في البيئة تأثير مؤقت على سيتوبلازم الخلايا حيث تعمل الخلايا على إعادة الرقم الهيدروجيني إلى وضعه الطبيعي Parton et al., 1997 وتعمل بعض المركبات في البيئة كأملاح النترات والأمونيا وكذلك المواد المصلبة كالآجار والجل رايت على ثبات نسبى للرقم الهيدروجيني. حيث يؤدى امتصاص الأيونات المشار إليها إلى تغير الرقم الهيدروجيني، ويتوقف ذلك على المكونات الأخرى للبيئة وطريقة التعقيم والنبات المنزرع. ومن الطبيعي أن ينخفض الرقم الهيدروجيني في البيئة المحتوية على NH4^- و NO₃^- بعد ضبطه على 5.8 عند إعداد البيئة. لكن يعود الرقم الهيدروجيني للارتفاع مرة أخرى حتى يصل إلى درجة قريبة من أو أعلى من تلك الابتدائية (2007 Prknov) و (2006) .Lucyszyn et al.

وقد أشار (2002) Ramage & Williams إلى انخفاض في الرقم الهيدروجيني وعدم تكشف أشطاء عند زراعة الأقراص الورقية لنبات الدخان في بيئة تحتوي على الأمونيا فقط كمصدر للنتروجين بينما لم يسجل ذلك الانخفاض وتكشفت الأشطاء عند اضافة النترات مع الأمونيا.

وربما تضاف بعض الأحماض العضوية للبيئة للعمل على ثبات الرقم الهيدروجيني عند 5.5 تقريباً. لكن في بعض المزارع المتخصصة كمزارع البروتوبلاست وزراعة المعلق الخلوي بكثافة منخفضة يتطلب الأمر استعمال بعض المركبات المتخصصة مثل Tris(hydroxymethyl)aminomethane و TRIS و  MESوغيرها لثبات الرقم الهيدروجيني. وقد سجل (1960) Klein & Manos زيادة في نشاط نمو لخلايا الدخان عند اضافة MES بتركيز 0.5 ميكرومول. وهناك العديد من الدراسات التي تبين التأثير الإيجابي لـ MES على تنظيم الرقم الهيدروجيني ونمو مزارع أنسجة العديد من الأنواع النباتية. وعموماً لا يعتبر MES ساماً للخلايا النباتية على الرغم من اشارة (2008) .De Kerk et al إلى انخفاض معدل تكوين الجذور على سيقان التفاح بزيادة تركيز MES ولم يكن هناك تأثير مفهوم لذلك التثبيط الذي لوحظ في الأيام الأولى من الزراعة اثناء نشوء القمم الميرستيمية واختفى فعله أثناء طور النمو. وقد لاحظ (2006) .Woodward et al زيادة عدد الأشطاء المتكشفة في مزرعة لأشجار Eucalyptus marginata عند اضافة MES للبيئة وكان أفضل معدل لتكوين الجذور عند تركيز 7.5 مليمول من النتروجين بنسبة 2:1 نترات إلى أمونيا وإضافة 10 مليمول من MES لتنظيم الرقم الهيدروجيني. ولم يكن للتركيز الأقل من MES القدرة على تنظيم الرقم الهيدروجيني خلال أربعة أسابيع من الزراعة عند استعمال النترات كمصدر وحيد النتروجين. كذلك يقلل وجود الفحم المنشط من انخفاض الرقم الهيدروجيني أثناء الزراعة حيث كان في مدى 5.4 - 6.1 خلال ثلاث أسابيع من زراعة أنسجة نباتات Lagerstroemia indica في بيئة MS، أما في حالة عدم وجود الفحم المنشط فقد انخفضت القيمة إلى 3.1 - 4.7 خلال نفس المدة. ولم يكن لـ BA تأثيراً معنوياً على الرقم الهيدروجيني في هذه الحالة، لكن كان للتداخل بين الفحم المنشط والتعقيم تأثيراً معنوياً في انخفاض الرقم الهيدروجيني للبيئة وارتبط تأثير كل منهما بوجود الآخر كما هو مبين في جدول رقم (2) كما أوضحه .Eymar et al (2000).

جدول 2: تأثير الفحم المنشط، BA والتعقيم على الرقم الهيدروجيني ودرجة التوصيل الكهربي لبيئة MS المستعملة لزراعة أنسجة نبات Lagerstroemia indica كما أوضحه (2000) .Eymar et al.

تأثير التعقيم والحفظ على الرقم الهيدروجيني

يحدث تغير بسيط جدا في الرقم الهيدروجيني للبيئة يتراوح بين 0.3-0.5 أثناء التعقيم إذا كانت البيئة خالية من السكر وتركيز الفوسفات بها منخفض ويكون الانخفاض اقل نسبياً إذا كانت البيئة محتوية على السكر أما البيئة المحتوية على المالتوز، أو الجلوكوز ، أو الفركتوز فيكون الانخفاض فيها أكثر. ويتوقف مدى الانخفاض على الرقم الهيدروجيني عند التحضير حيث ينخفض إلى 4.2 و 1.5 و 8.1 بعد ضبطه عند تحضير البيئة على 5.0 و 6.4 و 8.5 على التوالي. وعند تعقيم البيئة السائلة المحتوية على السكر ينخفض الرقم الهيدروجيني إلى 7.50-5.71 كما يؤدى الآجار المضاف إلى البيئة إلى انخفاض بسيط في الرقم الهيدروجيني ليتراوح بين 4 - 4.6 إذا كانت البيئة مجهزة على نفس الرقم الهيدروجيني، ويتوقف مدى الانخفاض على تركيز الآجار. وذلك لحدوث تحلل مائي لبعض المركبات العضوية في البيئة أثناء التعقيم في وسط حامضي، وقد يعزى التحلل المائي الحادث في البيئة إلى نوع الآجار المستخدم.

ونلاحظ أن الأجار لا يتصلب عند انخفاض الرقم الهيدروجيني للمزرعة إلى 4.5-5.4 كذلك فإن جزء من السكر المضاف يتحلل مائيا عند الرقم الهيدروجيني 5.5 ويزيد التحلل بارتفاع درجة الحرارة ويرجع أغلب التغير في الرقم الهيدروجيني إلى سلفات الحديدوز غير المخلبية ونترات البوتاسيوم (في حالة استعمال الحديد في صورة غير مخلبية). وقد سجل (1986) .Skirin et al انخفاض الرقم الهيدروجيني لوسط MS السائلة أو المضاف إليها Difco Bactor بتركيز 6 جم/ لتر من 5.7 إلى 4.6 عقب التعقيم مباشرة ووصل إلى 4.1 و 4.4 بعد ستة أسابيع من تحضير البيئة السائلة والصلبة على التوالي. ويقلل الفحم المنشط المضاف للبيئة من الانخفاض الحادث عند التعقيم كما يبين جدول رقم (2) وتزيد حموضة البيئة سواء كانت معقمة في الأوتوكلاف أو بالترشيح بطول فترة التخزين. وللحد من ذلك ينصح بأن يكون التخزين في الظلام وعلى درجة حرارة منخفضة في الثلاجة حيث تشير دراسة Owens & (1991) Wozniak إلى عدم حدوث تغيير يذكر في بيئة MS المضاف إليها السكر والأجار عند تخزينها في الثلاجة، لكن انخفض الرقم الهيدروجيني إلى 4.9 عند تخزينها في الضوء على درجة حرارة الغرفة. ومن الناحية العملية تظهر المشاكل الآتية إذا كان الرقم الهيدروجيني منخفضاً جدا :

1. عدم ثبات اندول حامض الخليك وحامض الجبريلك.

2. عدم تصلب الآجار.

3. ترسيب أملاح الفوسفات والحديد.

4. عدم ثبات حامض Pantothonic.

5. إعاقة امتصاص الأمونيا.