زراعة القمم الميرستيمية وإنتاج نباتات خالية من الفيروس

تصنف هذه الطريقة كطريقة مختلفة عن زراعة القمم النامية والعقد الساقية ذات البرعم الواحد أو عديدة البراعم، إلا أنها تعتمد أيضاً على وجود القمة الميرستيمية المتكونة أصلا على النبات الأم. وكان من المعتقد أن التكاثر الجنسي يعتبر وسيلة لتفادى نقل الأمراض الفيروسية من الأم المصابة إلى النسل لكن أصبح من المؤكد الآن أن بعض الفيروسات تنتقل عن طريق البذور وبنسبة عالية جدا قد تصل إلى 25% (Cordoba Sellés et al 2007) ويعني ذلك أن التكاثر الجنسي لبعض النباتات ربما يساعد على انتشار الإصابة الفيروسية. وقد كان نجاح (1960) Morel مذهلا حيث استطاع الحصول على عدة آلاف من نباتات الأوركيد المعروفة بصعوبة إكثارها في سنة باستعمال قمة ميرستيمية واحدة. والآن يتم استخدام زراعة القمم الميرستيمية على نطاق تجارى وبنجاح في إنتاج الكثير من النباتات كالبطاطس (1988 ,Jones)، والفراولة والقرنفل، والموز والعديد من نباتات الزينة (2006 ,.Rout et al) الخالية من الأمراض الفيروسية والفطرية والبكتيرية. ولهذا أهمية كبرى في المحاصيل التي يعتمد إنتاجها على الإكثار الخضري مثل الموز (الشكل التالي) اعتماداً على كون القمم الميرستيمية للنباتات المصابة خالية أو محتوية على أقل تركيز من الفيروس، وقد يرجع هذا إلى:

1. معدل انقسام الخلايا في القمم الميرستيمية أعلى من معدل إصابتها بالفيروس.

2. النشاط الأيضي في الخلايا الميرستيمية عالياً بدرجة تعيق دخول الفيروس إليها. وربما يعزى ذلك إلى إنتاج الخلية لبعض المواد التي من شأنها إعاقة العدوى.

3. قد يثبط التركيز العالي من السيتوكينينات في الخلايا الميرستيمية نشاط الفيروس.

4. عدم اكتمال نمو الأنسجة الوعائية في القمم الميرستيمية وبذلك يكون انتقال الفيروس خلال خيوط البلازمودزماتا بطيء.

شكل يبين: مراحل اكثار الموز الخالي من الامراض عن طريق زراعة الانسجة حتى مرحلة الزراعة في الأرض المستديمة بمركز الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية – كلية الزراعة – جامعة المنيا – مصر.

وبصرف النظر عن سبب خلو الخلايا الميرستيمية من الإصابات الفيروسية فإن العلماء اتجهوا إلى دراسة إمكانية إنتاج نباتات خالية من الفيروس ببعض المعاملات التقليدية بمفردها أو بالدمج مع زراعة الأنسجة كزراعة القمم الميرستيمية أو البراعم الجانبية (2003 ,.Valero et al). وقد تمكن (2003) .Nascimento et al من دمج عدة طرق مع زراعة الأنسجة للحصول على نباتات بطاطس خالية من الفيروسات. ومن هذه الطرق:

1. المعاملة الحرارية أو ببعض المركبات التي تعيق انقسام الفيروس.

2. فصل وزراعة القمم الميرستيمية.

3. المعاملة الحرارية ثم فصل وزراعة القمم الميرستيمية.

4. تكشف الأفرع العرضية من نباتات مصابة متبوعا بفصل وزراعة القمم الميرستيمية.

5. تعريض النبات الأم لفترة إظلام ثم فصل وزراعة القمم الميرستيمية.

6. الحصول على خلايا ميرستيمية من الكالس أو البروتوبلاست.

يلاحظ من العرض السابق مدى أهمية فصل وزراعة القمم الميرستيمية في إنتاج نباتات خالية من الفيروس ويتم ذلك بفصل أجزاء صغيرة جدا من القمم القمة الميرستيمية طولها عادة 0.1 مم وقطرها حوالي 0.25. ويتم الفصل تحت المجهر وبدقة متناهية لتجنب إحداث ضرر بالقمة. ويكون المُستأصل النباتي على شكل حرف V بطول 0.3-0.5 مم بحيث تحتوي على منشآت الكامبيوم الذي يزيد من نسبة نجاحها. وكذلك يجب أن يتضمن المُستأصل النباتي واحد أو اثنين من مبادئ تكوين الأوراق وهو ما يشير إلى الثبات الوراثي في النباتات الناتجة لأنها ستتكشف من أنسجة متكشفة على النبات الأم وليس من براعم تكونت عقب ذلك. ويضيف (1999) Grout ضرورة استبعاد أي أنسجة وعائية من المُستأصل النباتي لتفادى وجود الفيروس. ويبين (1993) Dale & Cheyne العلاقة بين حجم الميرستيم وعدد النباتات التي يمكن الحصول عليها ومدى خلوها من فيروس MCMV في نباتات البرسيم الحجازي في الجدول التالي. وتؤخذ القمم الميرستيمية من النباتات متساقطة الأوراق عقب الخروج من دور السكون مباشرة، أما تلك المستديمة الخضرة فالوقت المناسب هو موسم النمو لعلاقة ذلك بنشاط الفيروس بالقمة الميرستيمية يزرع المُستأصل في وسط يشجع النمو وتكوين أفرع خالية من الإصابة. وبعدها يمكن إكثار الأفرع الناتجة بأي طريقة أخرى كمزارع القمم النامية أو العقد الساقية.

جدول يبين: العلاقة بين حجم الميرستيم القمي وعدد نباتات البرسيم الحجازي التي يمكن أقلمتها ومدى خلوها من فيروس MCMV كما وجدها (1993) Dale & Cheyne.

ولابد أن تتم عملية الفصل والزراعة بسرعة حتى لا تموت الأجزاء المنفصلة بسبب الهواء المتدفق من كابينة الزراعة أو حرارة الضوء المستعمل. ويفضل استعمال مجهر مزود بالضوء البارد أو استعمال الألياف الزجاجية لنقل الضوء لمسرح العمل (1996 ,Bhojwani & Razdan). تنقل الأفرع المتكشفة بعد ذلك إلى بيئة لتشجع نمو الجذور. وكان Morel & Martin أول من تمكنا بنجاح من استخدام هذه الطريقة للحصول على نباتات Dahlia خالية من الفيروس في سنة 1952. لكن من الناحية التطبيقية يصعب فصل هذا الجزء الصغير جداً دون حدوث ضرر يمنع نموه. ورغم سهولة الزراعة في بيئة شبه صلبة إلا أن الزراعة في بيئة سائلة مع تدعيم الجزء المنزرع فوق ورق ترشيح كركاب على شكل حرف m عادة ما يحسن من النمو. ويلاحظ أن فرصة تكوين الأفرع تزداد بزيادة حجم الجزء المنزرع لكنه قد يكون غير خالي من الفيروس، أما الأجزاء الصغيرة الحجم فغالبا ما تتجه إلى تكوين كالس أو جذور وغالباً يتكون الكالس من الخلايا المصابة أثناء العمل ويجب عند ملاحظة تكوين الكالس التخلص منه في أقرب فرصة لتفادى التغييرات الوراثية بسبب التكشف العرضي للبراعم حيث يؤكد (1999) Grout وجود تباين في المشابهات الإنزيمية بين النباتات الناتجة من الكالس وتلك المتكونة من القمم الميرستيمية مما قد يوحي بوجود اختلافات وراثية. وذلك على الرغم من عدم وجود اختلافات بين النباتات من حيث محتوى الخلايا من DNA واختلاف الطرز المظهري للنباتات الناتجة من الكالس. ومن ثم فإنه يفضل فصل القمة بطول حوالى 1 مم وقطر 5 مم ، وفى الغالب تنتج هذه القمة الميرستيمية نباتات خالية من الفيروس، مع ضرورة اختبار خلو النباتات الناتجة من الفيروس قبل إعادة إكثارها معملياً.

هناك صعوبة في تعقيم النباتات المتوردة rosette والتي تمتاز بتقزم الساق فتبدو الأوراق وكأنها خارجة من منطقة واحدة تقريباً معطية شكل وردة وغالباً ما يحدث استطالة سريعة للساق عند الإزهار. ولكي نضمن الحصول على نباتات خالية من التلوث يفضل فصل القمم النامية وزراعتها في بيئة غنية بالمواد المشجعة لنمو الكائنات الدقيقة مثل البيتون ومستخلص الخميرة لضمان عدم وجود تلوث داخلي. ويضاف إلى هذه البيئة بعض الهرمونات للعمل على استطالة الأفرع لتسهيل فصل القمة الميرستيمية وزراعتها بعد ذلك. تكون بعض خلايا الكالس المتكون من الأنسجة المصابة بالفيروس غير مصابة وتتكشف عنها نباتات سليمة. إلا أن الميرستيمات المتكونة تكون غير مضمونة الخلو من الفيروس كتلك الناتجة من زراعة الأنسجة الميرستيمية، وتزيد نسبة الخلايا غير المصابة إذا أخذ الجزء المنزرع من القمم الميرستيمية، وربما يرجع ذلك إلى سرعة انقسام الخلايا. ويمكن الرجوع إلى (1993) George و (1999) Grout للمزيد من المعلومات عن دور وكيفية استخدام زراعة القمم الميرستيمية للحصول على نباتات خالية من الفيروس.